本发明属于生物，具体涉及一种黄热病毒疫苗株3’utr缺失突变体的拯救及在制备减毒活疫苗中的应用。
背景技术：
1、黄热病毒(yellow fever virus,yfv)是一种古老的病毒，于1648年在墨西哥的尤卡坦半岛首次报道。该病毒50nm左右，有囊膜包裹，基因组为单股正链rna，长约11kb，两末端为非翻译区，中间含一个大的阅读框被翻译成多蛋白前体，随后被加工成3个结构蛋白(衣壳蛋白、膜蛋白、包膜蛋白)和7个非结构蛋白。
2、黄热病毒通过伊蚊传播，人被带毒蚊子叮咬后经树突状细胞传递到局部引流淋巴结并大量扩增，病毒及活化的免疫细胞随淋巴液进入外周血到达全身各个器官并引起病变。病毒在肝脏中大量复制引发分子连锁反应，导致促炎和抗炎细胞因子失衡，引起细胞因子风暴，严重的肝损伤和血管病变，病死率达5-50％，临床上无特效药，主要以干预疗法为主。
3、黄热病毒主要在南美洲和非洲的热带和亚热带地区流行，尽管自1937年以来已经出现了安全有效的减毒活疫苗(yfv-17d，以yfv-asibi野毒株在小鼠胚胎和鸡胚中连续传代获得)，但yfv仍然是这些流行地区的一个重要公共卫生问题。由于现在临床使用的yfv减毒活疫苗沿用古老的生产方法，必须在无特定病原体的鸡胚中生产，因此产量有限，且对鸡蛋等疫苗成分过敏人群禁用。在2016-2018年安哥拉和巴西的疫情爆发期间，疫苗供不应求，只能以1/5剂量接种。此外，疫苗问世以来，接种者出现过罕见的不良事件，还存在一些人群不能接种该疫苗，包括9个月以下的婴儿，哺乳期女性、60岁以上老人和鸡蛋过敏个体。为此，在全球科研工作者的努力下，10多种新的黄热病候选疫苗正处于不同的开发阶段。其中，灭活候选疫苗xrx-00159和重组病毒载体候选疫苗mva-bn-yf60已在i期临床试验中进行了测试。尽管xrx-001具有足够的安全性，但需要两剂接种才能在猕猴中诱导足够的保护性中和抗体，并且免疫持久性差。同样，mva-bn-yf也需要多剂量才能提供与单剂yfv-17d相当的免疫保护。因此二者均不是疫情到来之际或大规模疫苗接种运动中的理想候选疫苗。也没有进一步的研究推进二者的研发进程。与单次注射yfv-17d相比，最近开发的mrna候选疫苗也需要两次注射才能诱导恒河猴产生略低水平的中和抗体。17d-ir es(从yfv-17d的感染性克隆中获得)显示出比yfv-17d更好的安全性，但只有双针免疫结果被展示，缺乏足够的数据来支持其作为优良候选疫苗。对于其他新型候选疫苗，同样缺乏足够的证据和进一步的探索来证明其前景。因此，开发有效和更安全的二代黄热病疫苗仍然非常必要。
4、黄病毒成员的3’utr为高度结构化的非编码序列，在结构上具有一定的相似性。多种黄病毒，如登革病毒、寨卡病毒、西尼罗河病毒的3’utr被报道与病毒毒力相关，并作为减毒疫苗设计的靶点。yfv-17d的3’utr符合黄病毒属3’utr的基本特征，被划分为3个结构域，结构域ⅰ高度可变，结构域ⅱ相对保守，结构域ⅲ高度保守，其中结构域ⅱ含有登革病毒和寨卡病毒减毒活疫苗设计靶点相似的哑铃结构。为了进一步降低yfv-17d的毒副作用，提高使用安全性，本发明将yfv-17d基因组3’utr结构域ⅱ内哑铃结构对应的77个核苷酸删除，构建相应的感染性克隆，使用who唯一批准的可用于人类疫苗生产的vero细胞拯救病毒，由于3’utr通常不参与病毒结构蛋白的表达，因此缺失突变理论上不影响病毒主要免疫原包膜蛋白的表达，所以如果验证突变株具有减毒效应并具有不弱于yf v-17d的免疫原性和免疫保护性就有望开发出一款可以在vero细胞上生产的安全性更高的疫苗候选株，扩大接种人群并为可能的疫情大爆发提供足够的疫苗储备。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种黄热病毒疫苗株3’utr缺失突变体的拯救方法，方法简单，易行，易于大规模生产。病毒感染性克隆序列为seq id no.1所示。
2、本发明的另一个目的在于提供拯救的yfv-17d-δ77在制备黄热病毒减毒疫苗中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
3、一种黄热病毒疫苗株3’utr缺失突变体的获得方法：
4、(1)将yfv-17d的基因组(genbank accession no.jn628279)首尾添加sv40启动子序列和丁型肝炎核酶(hdvr)序列，通过合成生物学技术将这一完整序列进行合成在单拷贝质粒pcc1上，得到感染性克隆pcc1-yfv-17d。
5、(2)用分子克隆的方法在pcc1-yfv-17d中引入缺失突变(突变对应于yfv-17d基因组3’utr)得到pcc1-yfv-17d-δ77，将其转染vero细胞拯救得到重组病毒yfv-17d-δ77，所述重组病毒为seq id no.1所示。
6、本发明的保护范围还包括：
7、重组病毒yfv-17d-δ77经传代后获得的其他有效突变病毒，所述的突变病毒噬斑形态与yfv-17d-δ77相似，在vero细胞上复制速率与yfv-17d-δ77相似，对小鼠无致病力。
8、以上所述的重组病毒优选的，为seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所述重组病毒。
9、上述重组病毒在制备黄热病毒疫苗中的应用。
10、上述重组病毒在制备治疗或预防黄热病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
11、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
12、本发明提供的yfv-17d-δ77病毒通过20代传代后，δ77依然存在于病毒基因组中，积累了几个细胞适应性突变使病毒噬斑和生长曲线发生改变，但不影响病毒的致病力、免疫原性和免疫保护性。表明yfv-17d-δ77具有很好的遗传稳定性，可避免因批次不同而导致免疫效果不稳定的现象。
13、本发明提供的yfv-17d-δ77在ag129小鼠模型中证实相对于yfv-17d进一步减毒，在毒力低于yfv-17d的前提下，单针可提供不弱于yfv-17d的免疫保护。
14、单针可提供针对yfv-asibi的长效免疫保护。
15、综上所述，本发明提供的黄热病毒疫苗株3’utr缺失突变病毒yfv-17d-δ77，可以作为一种更安全的基于细胞的减毒疫苗弥补yfv-17d的不足，具有良好的应用前景和十分重要的理论和现实意义。
1. 一种黄热病毒疫苗株 3’utr缺失突变体重组病毒，所述的重组病毒为seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的重组病毒经传代后获得的其他有效突变重组病毒，所述的突变病毒噬斑形态与权利要求1所述重组病毒相似，在vero细胞上复制速率与权利要求1所述重组病毒相似，对小鼠无致病力。
3. 根据权利要求2所述的重组病毒，所述的重组病毒的序列为seq id no.2、seq idno.3或seq id no.4所示。
4.权利要求1或2所述的重组病毒在制备黄热病毒疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述的重组病毒在制备治疗或预防黄热病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
