本发明属于化学合成，特别是涉及一种左西孟旦二聚体杂质、其制备方法及检测方法。
背景技术：
1、左西孟旦(levosimendan)，(r)-[[4-(1,4,5,6-四氢-4-甲基-6-氧代-3-哒嗪基)苯基]-亚肼基]丙二腈，结构式如式ii所示：
2、
3、为钙离子增敏剂，由芬兰欧里昂(orion)公司研制开发，于2000年10月在瑞典首次上市，2021年2月原研进口。本品通过与肌钙蛋白相结合，使钙离子诱导的心肌收缩所必需的心肌纤维蛋白的空间构型得以稳定，发挥正性肌力作用，被广泛应用于治疗心衰和血管扩张，适用于需要增加心肌收缩力的急性失代偿心力衰竭(adhf)的短期治疗；而且，wo9321921还描述了左西孟旦在治疗心肌局部缺血中的良好效果，左西孟旦作为一种有效的正性肌力作用的钙增敏剂在国内外广受关注。
4、目前，左西孟旦的合成方法均以6-(4-氨基苯基)-4,5-二氢-5-甲基-3(2h)-哒嗪酮消旋体为起始物料，经d-(+)-二对甲氧基苯甲酰酒石酸拆分、重氮化、缩合反应实现左西孟旦的制备，制备路线如下：
5、
6、药物中存在的杂质类型及其含量对于药物疗效和安全性影响重大，因此药物工艺开发过程中必须对药物杂质谱进行全面分析，杂质的研究是质量控制中的重中之重。目前，除wo9965888a2公开了一种潜在基因毒性杂质，cn104478809a披露了左西孟旦合成过程中产生的杂质以外，关于其它杂质的研究报道很少。因此，急需对左西孟旦其它可能的杂质进行研究，并对左西孟旦的质量进行更为深入的研究考察，并提供有效的工艺研究方法以及检测方法对相关杂质进行严格控制，以保证左西孟旦用药的安全性。
技术实现思路
1、为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种左西孟旦二聚体杂质、其制备方法及检测方法。本发明提供的制备方法得到的该杂质纯度可达98％以上，可作为左西孟旦质量研究提供杂质对照品，从而降低左西孟旦临床用药风险，具有重要的应用价值。本发明的技术方案如下：
2、作为本发明的第一个方面，在于提供一种左西孟旦二聚体杂质，具有如式i所示的结构：
3、
4、该杂质由两分子的左西孟旦聚合生成，物化性质与左西孟旦相似，导致合成过程中不易分离，难以获得大量的、高纯度的上述杂质，无法对该杂质进行定性定量检测。
5、研究人员在对左西孟旦粗品精制过程中，意外发现该杂质。左西孟旦在溶剂中，随着温度的提高，会逐渐发生聚合，特别是酸性环境下，极易产生该杂质。该二聚体杂质过大，极大影响着左西孟旦原料药的质量，从而影响左西孟旦临床用药安全性，增大了患者使用的临床风险。
6、因此，对于该二聚体杂质的研究意义重大，确定其结构，有效控制其在左西孟旦原料药中的含量，对于提高左西孟旦原料药质量，降低左西孟旦临床用药风险具有重要意义。
7、优选的，所述左西孟旦二聚体杂质为盐、游离碱或溶剂化合物的形式。
8、作为本发明的第二个方面，在于提供所述二聚体杂质的制备方法，包括如下步骤：
9、将式ii化合物(左西孟旦)、酸与混合溶剂混合后，进行反应，制备式i所示的化合物；
10、其中，酸选自有机酸或无机酸，所述有机酸选自甲酸、乙酸或丙酸，无机酸选自盐酸或磷酸；
11、所述混合溶剂为水、醇类溶剂和酮类溶剂中的任意两种及以上的混合物；醇类溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇或叔丁醇中的任一种或两种及以上的混合物；酮类溶剂选自丙酮、丁酮中的任一种或两种及以上的混合物。
12、混合溶剂至少包含酮类溶剂，以及水或醇类溶剂选择至少一种，混合溶剂中酮类溶剂与水或醇类的体积比为5:1～20:1，混合溶剂优选为酮类溶剂与醇类溶剂的混合物。
13、优选的，左西孟旦与酸的体积质量比为0.1～1.0ml/g。
14、优选的，反应温度为60～70℃。
15、在本发明的一个具体实施方案中，所述反应是在如下条件进行的，将左西孟旦溶解在丙酮/异丙醇体系中，加热至60～65℃，搅拌反应72h，然后降温至0℃，析出大量固体，过滤后获得式ii和式i化合物的混合物；然后将混合物在石油醚/乙酸乙酯洗脱液下进行柱层析分离，最终获得目标产物。在整个反应的过程中，尝试调整混合溶剂中丙酮/异丙醇的体积比，以及反应温度，结果发现，不管如何优化反应条件，目标产物(化合物i)的收率不高于10％。目标产物收率过低造成应用成本高。
16、发明人在研究中，当采用有机酸加入反应体系时，意外发现：对于原料左西孟旦而言，以有机酸作为催化剂，酮类/醇类混合溶剂为反应溶剂，通过一锅煮的方式，可明显加快反应速率，提高目标产物的转化率和纯度，收率达40％以上。
17、而本发明采用的催化剂，在严格控制好催化剂用量的条件下。对原料的投料方式要求较低，可以选择一次性投料，且不需要控制升温速率，操作简单。对于本发明而言，化合物ii与催化剂有机酸的体积质量比为0.1～1.0ml/g，可以但不局限于0.2ml/g、0.4ml/g、0.6ml/g、0.8ml/g，有机酸的种类为甲酸、乙酸、丙酸。为了使化合物i获得更好的收率及纯度，化合物ii与有机酸的体积质量比为0.1～0.5ml/g，进一步优选地，化合物ii与有机酸的体积质量比为0.3～0.4ml/g。
18、在制备化合物i时，本发明的优选技术方案中，反应温度可以但不局限于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，为了获得更好的效果，反应温度为50～70℃。进一步优选地，反应温度为60～65℃。反应时间为12～168h，进一步优选为48～72h。
19、在制备化合物i时，本发明的优选技术方案中，所述的反应溶剂选自水，醇类溶剂和酮类溶剂；醇类溶剂，包括但不局限于甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇；酮类溶剂，包括但不局限于丙酮、丁酮的任一种或两种以上混合溶剂，为了获得更好的效果，进一步优选为醇类和酮类的混合溶剂，进一步优选为丙酮与异丙醇的混合物。
20、对于本发明而言，以左西孟旦为原料制备二聚体杂质时，混合溶剂为醇类或水与酮类溶剂的混合溶剂，左西孟旦与混合溶剂的总体积质量比5～15ml/g，可以但不局限于5ml/g、8ml/g、10ml/g、12ml/g，为了获得更高的收率及纯度，进一步优选化合物ii与混合溶剂的体积质量比5～9ml/g。
21、对于本发明而言，柱层析分离是对该杂质进行提纯的关键操作。
22、在一种优选技术方案中，所述的柱层析操作使用的硅胶为100～400目，进一步优选为200～300目；所述的柱层析操作使用的洗脱液选自石油醚/乙酸乙酯体系，比例为0.5～4:1，进一步优选为2～3:1。
23、本发明的另一目的在于提供一种用于检测左西孟旦样品中二聚体杂质的参比试剂，所述试剂为式i化合物。
24、或者本发明提供了所述的二聚体杂质作为参比试剂的应用，其特征在于，用于测定左西孟旦中二聚体杂质的含量。
25、本发明还提供了一种式i的左西孟旦杂质的检测方法，采用高效液相色谱法测定左西孟旦中该杂质的含量。
26、对于本发明而言，在一种优选技术方案中，所述高效液相色谱法为反相色谱法：优选色谱柱为c8、c18、苯基键合硅胶为填料的分析色谱柱，最优选为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。以磷酸盐缓冲液和乙腈为流动相，按照等度和梯度洗脱程序进行检测。所述的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾缓冲溶液，ph值控制在1～5范围内，最优选3～4范围内。
27、在本发明一个具体分析检测实例中，色谱柱：waters xbridge shield rp184.6mm×250mm,5μm，检测波长450nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样体积10μl，流动相为乙腈-磷酸二氢钾缓冲溶液。
28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
29、1，发明人在研究左西孟旦过程中发现了一种左西孟旦二聚体杂质，目前文献中还没有该杂质的发现、制备报道，完善了左西孟旦的质量控制；
30、2，本发明提供了左西孟旦杂质式i化合物的制备方法，填补了现有技术中对于该杂质制备的空白；
31、该制备方法反应条件温和，后处理简单，可以规模化制备出纯度符合要求的化合物，用以作为左西孟旦质量研究中的杂质对照品。可以用于杂质的定量和定性分析，从而提高了左西孟旦的临床用药安全性；
32、本发明选择有机酸为催化剂，混合溶剂为溶剂，在高温下以左西孟旦作为原料得到目标产物，相对于不加酸直接聚合反应，本发明提供的催化剂，在整个反应过程中，反应更快，后处理简单，收率更高，纯度达到98％以上；
33、3，本发明提供二聚体杂质的检测方法，方法简单，条件温和，使用普通的色谱柱即可快速有效分离左西孟旦和二聚体杂质。
1.一种左西孟旦二聚体杂质，其特征在于，具有如式i所示的结构：
2.根据权利要求1所述的左西孟旦二聚体杂质，其特征在于，所述左西孟旦二聚体杂质为盐、游离碱或溶剂化合物的形式。
3.左西孟旦二聚体杂质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂为酮类溶剂与醇类溶剂的混合物，酮类溶剂与醇类溶剂的体积比为5:1～20:1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合溶剂为丙酮与异丙醇的混合物。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，左西孟旦与酸的体积质量比为0.1～1.0ml/g。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，左西孟旦与混合溶剂的体积质量比5～9ml/g。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括反应后将体系降温至0℃析晶，过滤后获得混合物；将混合物经过柱层析纯化得到目标产物；柱层析操作使用的硅胶为100～400目，进一步优选为200～300目；所述的柱层析操作使用的洗脱液选自石油醚/乙酸乙酯体系，比例为0.5～4:1，进一步优选为2～3:1。
9.根据权利要求1所述的二聚体杂质作为参比试剂的应用，其特征在于，用于测定左西孟旦中二聚体杂质的含量。
10.根据权利要求1所述的左西孟旦二聚体杂质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定左西孟旦中该二聚体杂质的含量；
