本发明涉及医疗，特别是涉及一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用。
背景技术：
1、口腔白斑病(oral leukoplakia，olk)是发生于口腔黏膜以白色病损为主的损害，但olk的发生机制仍未明确，急需寻找针对olk的预测指标和潜在靶点，以此治疗olk并阻抑其恶性转化。
2、研究发现，经过降解的低分子量褐藻多糖硫酸酯(low molecule weightfucoidan，lmwf)具有强抗炎性，抗氧化性和抗肿瘤等多种生物活性，目前已被广泛应用于医药领域。由于lmwf结构独特，其还是sr-a，选择素等多种蛋白质的天然配体，可与sr-a靶向结合实现对疾病的治疗作用。研究发现lmwf能抑制sr-a从而阻抑olk的发生发展。由于口腔环境的特殊性，唾液和饮食等因素均会影响药物对口腔黏膜病灶的治疗效果。而lmwf作为一种水溶性杂多糖，在口腔中极易被稀释，传统口服和局部涂布等干预措施无法保障病灶处的有效药物浓度。因此，如何改善lmwf的药物给药途径，提高药物作用效率，是急需解决的关键问题。纳米材料由于其良好的物理性能和载药性能，在医用材料领域有广泛的应用前景。其中聚乳酸-聚己内酯具有优良的生物相容性，力学性能和降解性能。美国食品药物管理局(fda)已证实其是对人体最安全的材料之一。研究发现plcl包裹阿托伐他汀钙构建的壳芯纳米纤维支架可缓释阿托伐他汀钙，达到防止动脉瘤性蛛网膜下腔出血复发的目的。plcl负载表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)构建的plcl/明胶/egcg壳芯纳米纤维膜可持续释放药物，促进伤口愈合。但plcl复合生物材料在口腔疾病中的应用鲜有报道。因此，功能性纳米纤维plcl负载海洋多糖lmwf可作为一种潜在的生物贴片，为lmwf针对性治疗olk病灶提供新的思路和方法。
3、为此我们提出一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用。
技术实现思路
1、为了克服口腔环境的特殊性，改善现有治疗方式的不足，本发明提供一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用，通过一系列物化表征筛选最佳的纳米纤维膜，优化给药途径，实现局部病灶的精准给药。
2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
3、一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用，包括如下步骤：
4、步骤一、lmwf(mw＝8177da)的提取，收集海带样品，收集后洗涤并运输至实验室，采用热水蒸馏提取法提取lmwf；
5、步骤二、材料包括以下试剂：plcl(50:50,mn:300000)、六氟异丙醇(hfip)、dmmbtaylor’s blue、poly-l-lysine solution、l-多聚赖氨酸(pll)；
6、步骤三、lmwf/plcl共混纳米纤维膜的制备：plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中配制纺丝液，然后将lmwf水溶液加入到纺丝液中，混合溶液中lmwf的终浓度为50ug/ml，取plcl和lmwf的共混液于针筒中，通过单轴静电纺丝法制备lmwf/plcl共混纳米纤维膜，静电高压设置为12kv，流速设置为1.0ml/h，接收距离为12～15cm，制备完成的纤维膜-20℃保存；
7、步骤四、lmwf/plcl壳芯纳米纤维膜的制备：将plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中作为壳层溶液，将lmwf以50μg/ml浓度溶解于去离子水中作为芯层溶液，通过同轴静电纺丝法制备lmwf/plcl壳芯结构纳米纤维膜，壳层溶液流速分别设置为1.0ml/h，芯层溶液流速分别设置为0.8ml/h，静电高压设置为12kv，接受距离为12～15cm，制备完成的纤维膜-20℃保存；
8、步骤五、lmwf/plcl涂层纳米纤维膜的制备：plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中，通过单轴静电纺丝方法制备plcl纳米纤维膜，静电高压设置为12kv，流速设置为1.0ml/h，接受距离设置为12～15cm，制备好plcl纳米纤维膜后，通过等离子体对纳米纤维膜表面处理2min，然后室温浸泡在0.1％pll溶液中2h，pbs润洗三次后，浸泡在50μg/ml的lmwf水溶液中4℃过夜处理，pbs缓冲液润洗三次后烘干，制备完成的纤维膜-20℃保存；
9、步骤六、以上静电纺丝过程均在室温20-24℃、环境湿度35-50％下进行。
10、制膜前步骤如下：
11、步骤一、lmwf(mw＝8177da)的提取，收集海带样品，收集后洗涤并运输至实验室，采用热水蒸馏提取法提取lmwf；
12、步骤二、材料包括以下试剂：plcl(50:50,mn:300000)、六氟异丙醇(hfip)、dmmbtaylor’s blue、poly-l-lysine solution、l-多聚赖氨酸(pll)；
13、步骤三、lmwf/plcl共混纳米纤维膜的制备：plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中配制纺丝液，然后将lmwf水溶液加入到纺丝液中，混合溶液中lmwf的终浓度为50ug/ml，取plcl和lmwf的共混液于针筒中，通过单轴静电纺丝法制备lmwf/plcl共混纳米纤维膜，静电高压设置为12kv，流速设置为1.0ml/h，接收距离为12～15cm，制备完成的纤维膜-20℃保存；
14、步骤四、lmwf/plcl壳芯纳米纤维膜的制备：将plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中作为壳层溶液，将lmwf以50μg/ml浓度溶解于去离子水中作为芯层溶液，通过同轴静电纺丝法制备lmwf/plcl壳芯结构纳米纤维膜，壳层溶液流速分别设置为1.0ml/h，芯层溶液流速分别设置为0.8ml/h，静电高压设置为12kv，接受距离为12～15cm，制备完成的纤维膜-20℃保存；
15、步骤五、lmwf/plcl涂层纳米纤维膜的制备：plcl以10％的质量体积浓度溶解于hfip中，通过单轴静电纺丝方法制备plcl纳米纤维膜，静电高压设置为12kv，流速设置为1.0ml/h，接受距离设置为12～15cm，制备好plcl纳米纤维膜后，通过等离子体对纳米纤维膜表面处理2min，然后室温浸泡在0.1％pll溶液中2h，pbs润洗三次后，浸泡在50μg/ml的lmwf水溶液中4℃过夜处理，pbs缓冲液润洗三次后烘干，制备完成的纤维膜-20℃保存；
16、步骤六、以上静电纺丝过程均在室温20-24℃、环境湿度35-50％下进行。
17、制膜后步骤如下：
18、步骤一、将lmwf/plcl纳米纤维膜切成1×1cm的样品进行喷金处理，用电子扫描电镜观察纳米纤维的形态，选取50根纳米纤维采用image j图像分析软件对纳米纤维直径进行统计分析，将得到的数据使用origin9.0进行分析,绘制直径分布图；
19、步骤二、用尖头镊子夹持碳膜喷涂的铜网，置入纺丝静电场，接收一定量的同轴静电纺丝纳米纤维，编号后抽真空，保存于真空干燥皿中，待有机溶剂挥发后，在操作电压100k v条件下，使用透射电镜检测纳米纤维膜的壳芯结构；
20、步骤三、使用nicolet in10 ftir光谱仪表征样品(即lmwf粉末和lmwf/plcl纳米纤维膜)在500-4000cm-1范围内的ftir光谱，扫描分辨率为2cm-1，扫描次数为32次；
21、步骤四、采用接触角分析仪测定lmwf/plcl纳米纤维膜的表面水接触角(wca)，首先将纳米纤维膜剪成面积为1cm2左右的正方形，使纳米纤维表面干净平整，然后将50μl去离子水下降至纳米纤维膜上，10s后测量水滴切线和纳米纤维膜之间的夹角，每个样品需要在3个不同的位置重复以上操作，分别计算出各样品平均值和标准偏差；
22、步骤五、使用万能材料试验机来评估lmwf/plcl纳米纤维膜的力学性能，将lmwf/plcl纳米纤维膜裁剪成1cm×5cm的长方形样品，并固定在万能材料试验机两侧夹子上，拉伸速度为50mm/min；
23、步骤六、dmmb法检测了lmwf的释放情况，首先，将4mgdmmb染料溶解在250mlmilli-q水中，然后将甘氨酸(0.75g)和氯化钠(400mg)加入到得到的溶液中，并用1n盐酸调节溶液的ph至3后，得到的溶液用无菌滤膜(0.22μm)过滤以去除杂质，并储存在干燥、黑暗的环境中，采用紫外可见分光光度计在525nm处测定吸光度，计算出标准曲线(0-200ug/ml)并测定lmwf的浓度，三组纳米纤维膜分别取50mg的样品，并根据各组分之间的配比计算出样品中lmwf的理论含量，在5ml的人工唾液中充分搅拌后，在525nm处分别测出吸光度，根据标准曲线(r2>0.999)计算出溶液中的lmwf浓度；
24、drug loading efficiency(‰)＝(w1)/w3×1000
25、encapsulation efficiency(％)＝(w2-w1)/w2×100
26、式中：w1为实际lmwf含量；w2为理论lmwf含量；w3为样品质量；
27、步骤七、将三组lmwf/plcl纳米纤维膜(10mg)浸泡在5ml、ph＝6.8的人工唾液中，温度为37℃，以120rpm的恒定速率在恒温摇床上搅拌，然后分别于30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h时从中取1ml溶液随后再向剩余溶液中加入1ml人工唾液进行补充，用紫外可见分光光度计检测在波长525nm处检测吸光度值，每组纤维膜测3次取平均值，然后根据标准曲线方程计算出各时间点的药物的浓度以及药物累积释放百分比，并用origin9.0进行分析并绘制药物累积释放曲线；
28、步骤八、所有数据均以平均值±标准差(x±sd)表示，并使用graphpad prism 9.0软件对实验进行统计分析，使用student’s t检验比较两组之间的差异，使用单因素方差分析分析三组及三组以上数据的差异，误差条表示每组三次测量数据的标准差，采用turkey检验作为事后分析方法。如果p<0.05，则认为差异具有统计学意义。
29、与现有技术相比，本发明能达到的有益效果是：
30、通过静电纺丝技术成功开发了具有生物活性的壳芯结构lmwf/plcl纳米纤维膜，其具有较好的亲水性，有利于在口腔黏膜表面粘附；优异的机械强度，有利于在复杂的口腔环境保持形态；较高的载药率与包封率和较为平稳的lmwf释放率，有利于在olk病灶处保持较高的有效浓度，制备的纳米纤维膜还具有良好的生物相容性，体外实验表明其促进了olk细胞的凋亡，与前期单纯给药具有相同的治疗效果。
1.一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用，其特征在于：制膜前步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种褐藻多糖硫酸酯纳米纤维膜层状结构口腔贴片及制备方法和应用，其特征在于：制膜后步骤如下：
