本发明属于物质分析领域，具体涉及电磁场辅助冷冻组织平面化方法在制备用于植物学研究的maldi-msi样品中的应用。
背景技术：
1、基质辅助激光解吸/电离质谱成像(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging,maldi-msi)是一种有前景且强大的分子分析技术，可促进内源性和外源性化合物(如蛋白质、多肽、脂质、聚糖、神经递质、核苷酸、代谢物和药物分子)的无标签示踪，且具有高空间分辨率和高特异性。与免疫组化类似，maldi-msi能够实现组织样本中化合物的高通量原位检测，并且不需要抗体。尽管maldi-msi是一项成熟的技术，已广泛应用于生物学的各个领域，包括基础医学、动物学、微生物学和药学，但其在植物研究中的应用相对有限。原因之一是植物具有特定的结构如表皮蜡质、角质层和细胞壁，这些结构对于植物最大限度地减少水分流失和保护其免受生物和非生物侵害至关重要。嵌在外皮层的表皮蜡质和角质层通常被认为是植物的第一个亲脂性屏障。它们是植物在恶劣条件下生存的关键。然而，这些特定的结构使得植物细胞内源性化合物的直接maldi-msi分析成为挑战。maldi是一种用于质谱分析的软电离技术，通常不能穿透植物的这些结构屏障。因此，直接电离植物细胞的内源性分子的效果较差。此外，围绕植物细胞的多糖细胞壁为植物提供了刚性和机械支撑，同时也参与维持细胞形状和植物的生长方向。另一方面，这种结构也形成第二个天然屏障，阻止内源性分子穿过细胞壁进入基质层，然而内源性分子进入基质层对于成功进行化合物maldi-ms原位检测是必要的。
2、为克服上述障碍，适当的样品制备和处理方法对于实现植物内源化合物的有效电离是必要的，与此同时也需要以高空间分辨率的方式保持这些化合物定位和丰度的高保真。尽管迄今为止在植物组织maldi-msi样品处理领域已经取得巨大进展，例如使用有机溶剂清洗、物理去除、印迹和横向切片，但这些方法存在的缺点限制了maldi-msi在植物研究中的广泛应用。此外，尽管可以通过化学方法(如氯仿或正己烷清洗)或物理方法(如刀片刮擦或胶带粘除)去除植物的亲脂性屏障，从而暴露内源性化合物便于其进行maldi-ms检测，但这些方法往往会导致某些化合物的离域或部分丢失。另外，许多富含水分或柔软的植物组织如花或嫩叶，不能使用这些物理方法进行处理。为解决这一问题，研究人员开发了印迹技术作为可替代的样品处理方法。在印迹过程中，应用合适的压力将植物组织压在平面多孔或强吸附材料(如聚四氟乙烯、打印纸、薄层色谱板或胶带)上以期将内源性化合物转移到材料表面。尽管使用印迹技术可以规避与植物亲脂性屏障相关的限制，但分子分散和离域依然是待解决的问题，其经常会导致msi的空间分辨率较差。迄今为止，印迹技术最常用于解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization,desi)质谱成像，而在maldi-msi中很少有报道。因此，为解决上述问题，包括横向切片和纵向切片的组织薄切方法，已被普遍用于制备maldi-msi植物组织样本的替代步骤。据报道，由于样品的形状原因，横向切片方法被认为与植物样品的相容性更强。然而，纵向组织切片可以提供更多关于平面化植物组织中组织异质性和内源性分子分布的信息。遗憾的是，大多数不规则形状的植物样本，如花和叶，在其自然状态下表现出高度的不规则性，这使得找到任何一个贯穿整个组织的切面十分困难。结果，这些组织仍然与纵向切片不兼容，因此限制了maldi-msi在植物研究中的广泛应用和植物学相关领域的发展。具体而言，在植物空间组学中，由于现有样品制备技术的限制，对形态不规则组织中内源性代谢物的大规模原位表征一直受到阻碍。虽然获得连续的横向切片可以在一定程度上揭示代谢物的纵向分布，但是这种方法费时费力，并且往往很难实现组织样本所有连续切片的全面可视化。同样，在植物解剖学研究中也经常遇到类似的问题。对于植物病理学而言，生物因素引起的植物疾病往往表现为组织代谢物的细微变化，这使得植物的早期疾病检测具有较大困难。例如，病原体经常利用昆虫的刺吸式口器渗入植物，引发其内部组织疾病并且不会引起明显的形态学变化。虽然目前的实验方法，如横截面msi和液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,lc-ms)联用技术能够发挥一定研究价值，但它们在原位暴露全面的组织信息方面存在不足，而原位信息对于精确定位病变的特定位点和发展轨迹又是十分必要的。总而言之，开发方便有效的样品制备技术，实现不规则植物组织的纵向切片成为解决这些问题的关键需求。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种被称为电磁场辅助冷冻组织平面化(electromagnetic field-assisted frozen tissue planarization,emfaftp)的方法。emfaftp涉及将一对激活的电磁线圈应用于形态不规则的植物组织两侧。在优化的电磁场强度下，emfaftp在组织冷冻过程中诱导植物样品的非破坏性平面化和规则化。该方法将允许有效地制备适合纵向切片的植物组织样品，并通过maldi-msi进行更高效的内源性分子分析。在本发明研究中，我们成功设计并利用emfaftp成功地实现了不同类型的植物样本包括花瓣和叶片的纵向切片，能够通过maldi-msi更有效地检测和表征组织切片内不同分子量内源性分子的分布。发明人相信emfaftp技术可以为植物化合物质谱成像提供一个新的视角，这已经跨越了广泛的质谱和植物学学科，将有望解决植物科学研究中长期存在的一些障碍。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种电磁场辅助冷冻组织平面化(emfaftp)的方法。
4、本发明所提供的电磁场辅助冷冻植物组织平面化的方法，包括下述步骤：在冷冻的植物组织两侧施加一对磁场力可调节的平行电磁场以实现冷冻组织平面化。
5、优选地，所述植物组织为不规则形状的植物组织。所述植物组织包括但不限于：花和叶等。
6、优选地，在冷冻组织平面化过程中通过调节直流电源电压来改变双向电磁铁产生的吸引力的大小。
7、进一步地，所述方法通过下述步骤实现：构造电磁场装置：选择两个平板金属板，并在每个金属板的一侧贴上滤纸，将所述两个平板金属板面对面平行放置，且滤纸层位于两个平板金属板相对的内侧面；将所述的两个平板金属板分别连接到一个激活的电磁线圈；
8、使两个平板金属板的温度保持在-18至-20℃，植物组织被放置在两个金属板相对空间的中央位置，在emfaftp实行过程中，对每个金属板施加直流电压以产生磁场方向相同的一对电磁场，在植物组织样品上施加电磁力，在优化强度的电磁场作用下，组织样品在电磁力作用下逐渐变平整。
9、具体地，两个平板金属板的尺寸相同，每个金属板的尺寸可为7.5×7.5cm，厚度为0.5-1.5mm。
10、具体地，所述滤纸的总厚度为1-3毫米。所述滤纸附着在金属平台的两侧以缓冲施加的压力。
11、设计中的电磁场可能会产生过度的吸引力从而导致组织破损。因此，找到不同植物组织所能承受的最佳电磁力对于避免组织破裂至关重要。该过程是通过逐步地调整施加在电磁线圈上的电压来完成的。电压以0.01v的间隔稳步增加，以确定每种植物组织的最佳电磁力。一旦为某个植物样本优化了电压，该植物组织随后将置于优化的平面化条件(最佳电磁力条件)下固定10min以使其形状规则，然后进行如下所述的纵向组织切片。
12、为使用本发明提出的emfaftp方法实现不规则植物组织的最佳规则化，有必要确定双向电磁铁产生并施加在组织样品上的最佳力。根据emfaftp的设计原理，组织所能承受的可变电压和最大力的方程被建立。具体地说，通过改变电压值，施加给不同植物组织的力可以逐步优化到组织可以承受的最大力，以实现平面化。当施加较大的力时，由于组织破裂植物组织的渗出液会流出到滤纸上，这将导致植物内源性分子中具有价值的原位信息丢失。除了控制施加电场力的大小外，冷冻组织平面化时的温度也需要适当控制。在本发明的实验中，-20℃的温度被确定为保持内源性分子稳定性的合适温度，与此同时也能够保持组织形状，特别是当高含水量的柔软组织进行emfaftp处理时。
13、具体地，植物组织以选自蝴蝶兰的花瓣样本和选自南方红豆杉的叶片样品为例，在冷冻组织平面化过程中，根据不同组织的弯曲强度对施加的电压进行优化和调整。优化后的电压及其相应的力见下文中表1所示。
14、在emfaftp方法中，使用双向电磁铁来产生可调节的力，这将有利于实现多种植物组织类型的通用处理。
15、本发明提供的emfaftp的方法实现了不规则植物组织的高效、无损的平面化和规则化，从而促进植物组织进行纵向切片并实现其内源性分子的大规模暴露，以进行后续的msi检测。
16、第二方面，本发明提供了一种制备植物组织纵向切片的方法。
17、本发明所提供的制备植物组织纵向切片的方法，包括下述步骤：
18、1)采用本发明第一方面所述的方法处理植物组织；
19、2)对步骤1)处理后的植物组织进行纵向切片，即得。
20、所述植物组织包括但不限于：花和叶等。
21、对于比较脆弱且薄的组织植物(如花瓣、叶片等)，传统的纵向切片方法难以得到合适的切片。因此，本发明提出了一种新的切片方法，可以同时应用于花和叶组织制备切片。所述切片方法包括下述步骤：首先将每个花或叶样本的外层组织切去，然后将每个样本的剩余部分作为纵向组织切片进行之后的研究。组织切片前花瓣和叶片的完整组织厚度用螺旋测微计测量，切片过程中确保剩余组织标本的厚度为30μm。
22、根据本发明的实施例，所述切片方法具体如下：首先将冰块(尺寸如50mm×5mm)固定并切除不平的部分以获得平整光滑的冰面；接下来，将ito导电玻片的非导电面用水湿润，并紧紧地贴在冰块的平面上直到两者结合在一起，用移液器向间隙缓慢加水进一步冷冻固定。随后，将合适尺寸的双面碳导电胶带(ted pella,inc.；redding,california,usa)粘附在ito导电玻片的导电侧。用emfaftp处理后的冷冻花瓣或叶片组织被平稳地放置在导电胶带表面，然后轻轻按压以稳定组织。随后对组织进行纵向切片。切片过程通过旋转刀片小心地控制并且在切片过程中计算已经被切除的组织的厚度。当剩余组织达到适当的切片厚度时，刀片旋进距离降至1μm。一旦纵向切片完成，承载组织切片的导电玻片将从冰表面小心移下。在进行maldi-ms分析前，将组织切片放置在0.1psi的真空干燥器中30min。
23、需要注意的是，在切片过程中冰表面、玻片和植物组织必须彼此平行，以保持切片过程中的组织完整性。此外，应考虑组织切除部分的厚度，因为如果剩余组织太厚其内源性分子的电离可能会受损害；优选厚度为30μm。这一系列操作可从感兴趣的不规则形状植物样品中得到高质量的组织切片(图2)，同时也表明本发明提供的切片方法可作为emfaftp的补充方法，便于获得适合maldi-msi分析的薄组织样品。
24、上述方法制备得到的植物组织纵向切片也属于本发明的保护范围。
25、第三方面，本发明提供了一种对植物组织内源性分子进行maldi-ms原位检测和/或成像的方法。
26、本发明所提供的对植物组织内源性分子进行maldi-ms原位检测和/或成像的方法，包括下述步骤：1)采用本发明第二方面所述的制备植物组织纵向切片的方法制备得到植物组织纵向切片；2)向植物组织纵向切片上喷涂基质，进行maldi-ms原位检测和/或成像分析。
27、进一步地，所述植物组织内源性分子包括植物内源性代谢物和蛋白质，具体包括脂类、黄酮、生物碱和氨基酸和寡肽等。
28、进一步地，所述基质可为3,4-二甲氧基肉桂酸(dmca)或芥子酸(sinapic acid,sa)。
29、所述dmca溶液的配制方法如下：将dmca溶于乙腈/水/tfa(90:10:0.1,v/v/v)混合溶液中，使其浓度为10mg/ml。所述sa溶液的配制方法如下：将sa溶于含有0.1％ tfa的80:20乙腈/水(v/v)中，使其浓度为25mg/ml。
30、所述喷涂基质的程序为：采用5s喷涂后60s干燥的循环方式进行基体喷涂；总共40个循环应用于每个组织以产生所需的基质薄层。
31、喷涂基质后，即可进行maldi-ms原位检测和/或成像分析，在常规条件下进行检测分析即可，如使用bruker autoflex speed maldi-tof/tof质谱仪进行数据采集及质谱成像实验。采用2000hz固态smartbeam nd:yag紫外激光器(355nm,azura laser ag)作为激光源。对于内源性代谢物和蛋白质的原位检测和成像，在正离子模式下，代谢物的质量采集范围为m/z 100-1500，蛋白质的质量采集范围为m/z 2000-20000。在maldi-ms数据采集过程中，通过30次激光扫描、每次扫描500激光发射的方式获得的信号累积产生质谱图。
32、根据本发明的实施例，我们选择dmca作为基质对两种植物组织的内源代谢物进行原位检测和正离子模式成像，而sa则作为基质对两种组织中的蛋白质进行原位成像分析。
33、本发明提出了一种称为emfaftp的新技术，成功地实现了不规则形状植物组织的非破坏性平面化和规则化。结果表明，该方法可成功应用于不同类型植物组织的前处理过程。此外，该技术显著提高了纵向切片的可操作性，不仅完全克服了植物特异性结构(如表皮蜡质、角质层和细胞壁)的局限性，而且还提供了特定组织内源性化合物的大规模原位信息。事实上，在emfaftp辅助下对选定的植物组织进行纵向切片后以期进行增强的组织成像时，通过maldi-msi分析的确成功检测到许多内源性代谢物和蛋白质。因此，本发明的方法显然有利于进一步研究不规则植物组织中特定分子的空间分布和相对丰度，并有望将其纳入植物科学中内源代谢物和蛋白质的增强maldi检测和成像的常规实践。该方法将在未来进一步应用于各种植物，特别是药用植物、作物和观赏植物的花瓣和叶片，促进maldi-msi进入植物空间组学的新时代。我们期望我们的方法能够促进植物学各个领域研究取得实质性进展，包括但不限于植物空间组学，植物解剖学，植物病理学以及植物与昆虫的相互作用。
1.一种电磁场辅助冷冻植物组织平面化的方法，包括下述步骤：在冷冻的植物组织两侧施加一对磁场力可调节的平行电磁场以实现冷冻组织平面化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于优选地，所述植物组织为不规则形状的植物组织；所述植物组织包括但不限于：花、叶；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法通过下述步骤实现：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述两个平板金属板的尺寸相同，每个金属板的尺寸可为7.5×7.5cm，厚度为0.5-1.5mm；
5.一种制备植物组织纵向切片的方法，包括下述步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述切片方法更具体的步骤如下：首先将冰块固定并切除不平的部分以获得平整光滑的冰面；接下来，将ito导电玻片的非导电面用水湿润，并紧紧地贴在冰块的平面上直到两者结合在一起，用移液器向间隙缓慢加水进一步冷冻固定；随后，将合适尺寸的双面碳导电胶带粘附在ito导电玻片的导电侧；采用权利要求1-4中任一项所述的方法处理的植物组织被平稳地放置在导电胶带表面，然后轻轻按压以稳定组织，随后对组织进行纵向切片；切片过程通过旋转刀片小心地控制并且在切片过程中计算已经被切除的组织的厚度，当剩余组织达到适当的切片厚度时，刀片旋进距离降至1μm，一旦纵向切片完成，承载组织切片的导电玻片将从冰表面小心移下，在进行maldi-ms分析前，将组织切片放置在0.1psi的真空干燥器中30min。
7.一种对植物组织内源性分子进行maldi-ms原位检测和/或成像的方法，包括下述步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物组织内源性分子包括植物内源性代谢物和蛋白质。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基质为3,4-二甲氧基肉桂酸(dmca)或芥子酸(sinapic acid,sa)；优选的，所述dmca溶液的配制方法如下：将dmca溶于乙腈/水/tfa(90:10:0.1,v/v/v)混合溶液中，使其浓度为10mg/ml；所述sa溶液的配制方法如下：将sa溶于含有0.1％tfa的80:20乙腈/水(v/v)中，使其浓度为25mg/ml。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述喷涂基质的程序为：采用5s喷涂后60s干燥的循环方式进行基体喷涂；总共40个循环应用于每个组织以产生所需的基质薄层。
