本发明属于铬污染治理，具体涉及一种利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法及微生物菌剂。
背景技术：
1、目前，铬污染场地的修复方法主要分为物理修复、生物修复和化学修复三大类。物理修复包括换土法，更换的土方量越多，修复效果越明显，但此方法实际应用过程中需要花费大量的人力和财力，只适用于小面积严重污染。化学修复包括固化/稳定、化学还原、化学淋洗和电动修复。化学方法具有适用范围广、修复成本低、修复时间短等特点，但修复后的场地随着时间的延长易出现再次氧化的二次污染风险。生物修复包括植物修复、微生物修复和微生物-植物联合修复法，主要利用微生物、植物对重金属的吸附、提取、降解、固定等过程去除环境中的六价铬，但修复周期较长。
2、现有的修复技术以化学-生物联用，如cn202410316068.4公开了一种化学-生物联合修复高浓度六价铬污染土壤方法；电动-微生物联用，如cn202311142100.3公开了一种固定化威尼斯不动杆菌联合电动渗透对铬污染土壤修复的方法；植物-微生物联用，如cn202311047257.8公开了一种改良剂-植物-微生物联合原位修复重金属污染土壤的方法，等为主，联用技术虽一定程度上减弱了单一技术的缺陷，但其缺陷仍不能完全消除。微生物修复技术具有环保和经济的优点，但其同时存在修复周期长、微生物活性不稳定等缺点。如何低成本、环保的缩短微生物修复周期、提高微生物在土壤体系中的稳定性，对微生物修复技术的广泛运用具有重要意义，同时也在六价铬污染土壤修复中受到普遍关注。
3、现有利用生物炭负载微生物以提高微生物在土壤体系中的稳定性的技术，向土壤中添加含有机还原性物质的有机废水的修复技术可在还原六价铬的同时为微生物提供营养物质以加速微生物生长、缩短修复周期，如cn202310223746.8公开了一种采用有机废水且用于六价铬污染土壤治理的修复剂，cn202310819400.4公开了一种微生物-生物炭联合修复矿区重金属铬污染土壤的方法。但现有的生物炭负载微生物技术以负载单一功能微生物为主，单一菌种在复杂的土壤体系中抗干扰能力弱。
技术实现思路
1、本发明采用原料易得的生物炭负载多种铬还原功能微生物，适应性更强，同时以畜禽粪便和农林废弃物堆肥获得的产品替代有机废水，避免使用成分复杂且有渗透污染地下水风险的有机废水，不易产生二次污染且能实现固体废物的资源化利用。
2、本发明首先提供了一种利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其包括以下步骤：
3、a、制备1号微生物菌剂：分别对枯草芽孢杆菌bncc188080、地衣芽孢杆菌bncc221464、黄孢原毛平革菌bncc190652、潮湿纤维单胞菌bncc336467和解淀粉芽孢杆菌bncc132483进行培养，培养至各菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2，得到五种菌液，按枯草芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：潮湿纤维单胞菌：解淀粉芽孢杆菌：黄孢原毛平革菌的菌液体积比为3±0.1：3±0.1：2±0.1：1±0.05：1±0.05混合均匀，得到1号微生物菌剂，然后采用无菌生理盐水稀释8～10倍，待用；
4、b、制备堆肥产品：将畜禽粪便和农林废弃物按质量比为1.8～2.2：1充分混拌，在混拌过程中加入稀释后的1号微生物菌剂并均匀喷水，制成堆体(堆体大小可以根据所需堆肥产品量确定)，堆体含水率控制为55％～60％；然后进行好氧发酵，发酵过程中适当频率进行翻堆(一般每7d进行一次翻堆)并适当喷水保证含水量在55％～60％，完成堆肥后，粉碎，得堆肥产品；
5、c、制备2号微生物菌剂：分别对shewanella oneidensis mr-1、shewanellaputrefaciens cn-32和pseudomonas stutzeri ls-2进行培养，培养至各菌液在600nm波长下的吸光值为1.0～1.2，得到三种菌液，按shewanella oneidensis mr-1：shewanellaputrefaciens cn-32：pseudomonas stutzeri ls-2的菌液体积比为2±0.1：1±0.05：1±0.05混合均匀，得到混合菌液；将混合菌液和生物炭制备为微生物小球，即得2号微生物菌剂；
6、d、六价铬污染土壤修复：将步骤b所得堆肥产品和待修复土壤按质量比为8％～12％的施用量混匀，加入待修复土壤质量0.5％～1％的2号微生物菌剂和1％～2％的乳酸钠，进行土壤修复，待土壤修复完成即可。
7、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤a中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、潮湿纤维单胞菌和解淀粉芽孢杆菌的培养基为：牛肉粉3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l，ph值：7.3±0.1。
8、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤a中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和潮湿纤维单胞菌的培养条件为：在30±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养18～24h)。
9、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤a中，解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：在37±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养18～24h)。
10、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤a中，黄孢原毛平革菌的培养基为：马铃薯浸粉：10.0g/l，葡萄糖：20.0g/l，kh2po4：3.0g/l，mgso4·7h2o：1.5g/l，硫胺素：0.008g/l，ph：6.0±0.2。
11、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤a中，黄孢原毛平革菌的培养条件为：在30±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养3～5d)。
12、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤b中，所述畜禽粪便为新鲜猪粪或新鲜牛粪(新鲜畜禽粪便的含水率一般为60％～70％)。
13、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤b中，所述农林废弃物为玉米秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆(农林废弃物为自然风干并粉碎后的秸秆，其含水率一般为5％～12％，粉碎成10～50mm的均匀小段)。
14、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤b中，所述稀释后的1号微生物菌剂的加入量为0.2～0.3l/kg畜禽粪便和农林废弃物总质量。
15、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤b中，所述好氧发酵的时间为30～35d。
16、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤b中，所得堆肥产品的粒度为1～5mm。
17、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤c中，shewanella oneidensis mr-1、shewanella putrefaciens cn-32和pseudomonas stutzeri ls-2的培养基为：牛肉粉3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l，ph值：7.3±0.1。
18、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤c中，shewanella oneidensis mr-1、shewanella putrefaciens cn-32和pseudomonas stutzeri ls-2的培养条件为：在25～28℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为1.0～1.2(一般培养8～14h)。
19、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤c中，所述将混合菌液和生物炭制备为微生物小球的具体步骤为：将混合菌液进行离心后弃去上清液，加入无菌生理盐水重悬后再离心，重复2～3次(加入无菌生理盐水重悬后再离心的总操作次数为3～4次)；然后使用无菌生理盐水将菌液浓度调节至od600为1.0～1.2，加入1.0～1.5g/l的生物炭，振荡后，加入0.2～0.3g/l的无菌海藻酸钠和0.5～0.8g/l的无菌聚乙烯醇，经搅拌、静置后，将菌液滴入无菌饱和硼酸钙溶液中，形成稳定的微球结构；微球依次经冷冻静置、过滤、洗涤和真空冷冻干燥，即得微生物小球(其可存储于4℃冰箱待用)。
20、其中，上述修复铬污染土壤的方法中，制备微生物小球时，混合菌液进行离心的条件为6000～8000rpm条件下离心5～10min。
21、其中，上述修复铬污染土壤的方法中，制备微生物小球时，每次重悬时，无菌生理盐水和混合菌液的体积比为2～5：8。
22、其中，上述修复铬污染土壤的方法中，制备微生物小球时，振荡的条件为28～30℃下150～180rpm振荡1～2h。
23、其中，上述修复铬污染土壤的方法中，制备微生物小球时，静置的时间为30～60min；
24、其中，上述修复铬污染土壤的方法中，制备微生物小球时，所述冷冻静置的条件为0～5℃静置24～36h。
25、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤c中，所述生物炭由以下方法制备得到：将生物质烘干粉碎后，于惰性气氛下，以升温速率为10～30℃/min升温至400～700℃，并保温1～4小时，进行碳化，得碳化物；将碳化物和活化剂按质量比为1：1～3混合均匀，然后于惰性气氛下，以升温速率为10～30℃/min升温至400～700℃，并保温1～4小时，进行活化，得生物炭。
26、其中，上述修复铬污染土壤的方法，步骤d中，所述土壤修复的时间为30～40天，修复过程中每天浇水保证土壤含水量为55％～60％，每隔两天翻耕。
27、本发明还提供了一种用于修复铬污染土壤的微生物菌剂，其由1号微生物菌剂和2号微生物菌剂按体积质量比为4～6ml：5g组成；
28、其中，所述1号微生物菌剂由以下方法制备得到：分别对枯草芽孢杆菌bncc188080、地衣芽孢杆菌bncc221464、黄孢原毛平革菌bncc190652、潮湿纤维单胞菌bncc336467和解淀粉芽孢杆菌bncc132483进行培养，培养至各菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2，得到五种菌液，按枯草芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：潮湿纤维单胞菌：解淀粉芽孢杆菌：黄孢原毛平革菌的菌液体积比为3±0.1：3±0.1：2±0.1：1±0.05：1±0.05混合均匀，即得；
29、所述2号微生物菌剂由以下方法制备得到：分别对shewanella oneidensis mr-1、shewanella putrefaciens cn-32和pseudomonas stutzeri ls-2进行培养，培养至各菌液在600nm波长下的吸光值为1.0～1.2，得到三种菌液，按shewanella oneidensis mr-1：shewanella putrefaciens cn-32：pseudomonas stutzeri ls-2的菌液体积比为2±0.1：1±0.05：1±0.05混合均匀，得到混合菌液；将混合菌液和生物炭制备为微生物小球，即得。
30、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备1号微生物菌剂时，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、潮湿纤维单胞菌和解淀粉芽孢杆菌的培养基为：牛肉粉3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l，ph值：7.3±0.1。
31、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备1号微生物菌剂时，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和潮湿纤维单胞菌的培养条件为：在30±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养18～24h)。
32、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备1号微生物菌剂时，解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：在37±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养18～24h)。
33、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备1号微生物菌剂时，黄孢原毛平革菌的培养基为：马铃薯浸粉：10.0g/l，葡萄糖：20.0g/l，kh2po4：3.0g/l，mgso4·7h2o：1.5g/l，硫胺素：0.008g/l，ph：6.0±0.2。
34、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备1号微生物菌剂时，黄孢原毛平革菌的培养条件为：在30±1℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为0.8～1.2(一般培养3～5d)。
35、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备2号微生物菌剂时，shewanella oneidensis mr-1、shewanella putrefaciens cn-32和pseudomonasstutzeri ls-2的培养基为：牛肉粉3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l，ph值：7.3±0.1；
36、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备2号微生物菌剂时，shewanella oneidensis mr-1、shewanella putrefaciens cn-32和pseudomonasstutzeri ls-2的培养条件为：在25～28℃摇床150～180rpm好氧条件下培养至菌液在600nm波长下的吸光值为1.0～1.2(一般培养8～14h)；
37、其中，上述用于修复铬污染土壤的微生物菌剂中，制备2号微生物菌剂时，所述将混合菌液和生物炭制备为微生物小球的具体步骤为：将混合菌液进行离心后弃去上清液，加入无菌生理盐水重悬后再离心，重复2～3次(加入无菌生理盐水重悬后再离心的总操作次数为3～4次)；然后使用无菌生理盐水将菌液浓度调节至od600为1.0～1.2，加入1.0～1.5g/l的生物炭，振荡后，加入0.2～0.3g/l的无菌海藻酸钠和0.5～0.8g/l的无菌聚乙烯醇，经搅拌、静置后，将菌液滴入无菌饱和硼酸钙溶液中，形成稳定的微球结构；微球依次经冷冻静置、过滤、洗涤和真空冷冻干燥，即得微生物小球(其可存储于4℃冰箱待用)。
38、本发明中，1号菌剂所用微生物菌种均为市售，枯草芽孢杆菌bncc188080、地衣芽孢杆菌bncc221464、黄孢原毛平革菌bncc190652、潮湿纤维单胞菌bncc336467和解淀粉芽孢杆菌bncc132483，均购自北京北纳创联生物技术研究院。
39、本发明中，2号菌剂所用微生物菌种均为市售，shewanella oneidensis mr-1和shewanella putrefaciens cn-32购自中国典型培养物保藏中心(cctcc)，编号分别为：cctcc ab 2013238和cctcc ab 2013239。pseudomonas stutzeri ls-2购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为cgmcc no.11556。pseudomonas stutzeri ls-2也可参考论文引用信息：li,s.,li,x.&li,f.fe(ii)oxidation and nitrate reduction by adenitrifying bacterium,pseudomonas stutzeri ls-2,isolated from paddy soil.jsoils sediments 18,1668–1678(2018)。
40、本发明中，生物炭可采用市售成品，也可自制。自制时，生物质可采用本领域常见生物质，如芒果核、花生壳、椰子壳、核桃壳等；考虑到攀枝花盛产芒果，本发明实施例中以芒果核为原料制备生物炭。
41、制备生物炭时，通过加入活化剂活化，能够有效增加比表面积，提升修复效果；活化剂可采用本领域常见活化剂，如koh、naoh、水蒸气、盐酸、硫酸等均适用于本发明。
42、本发明中，无菌生理盐水的质量浓度一般为0.85％。
43、本发明中，制备2号微生物菌剂时，1.0～1.5g/l的生物炭、0.2～0.3g/l的无菌海藻酸钠和0.5～0.8g/l的无菌聚乙烯醇中，“l”为调节od600为1.0～1.2时的菌液体积。
44、本发明的有益效果：
45、本发明采用原料易得的生物炭负载多种铬还原功能微生物，制备的生物炭负载功能微生物小球方便使用，且在土壤体系中适应性更强。本发明将1号菌剂、畜禽粪便和农林废弃物堆肥获得的产品添加在污染土壤中，堆肥产品中的腐殖质等能作为穿梭体，能够加速2号菌剂中功能微生物还原铬，同时还能为微生物的生长繁殖提供碳源，堆肥的使用不易产生二次污染且能实现固体废物的资源化利用。
46、本发明使用的1号和2号微生物菌剂均由多种微生物复合而成，其中2号菌剂经过固化处理后使用，即将其负载于芒果核制备的生物炭上，经海藻酸钠凝胶固定化后制成小球状的微生物菌剂，能够更有效将铬还原固定，保证土壤修复后的长期安全性，所使用的微生物菌剂具有高效、绿色环保、材料易得等优点。
47、本发明的施氏假单胞菌ls-2的保藏编号为cgmcc no.11556。保藏时间为2015年11月02日，保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。分类命名为pseudomonas stutzeri ls-2。
1.利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤a中，至少满足下列的一项：
3.根据权利要求1所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤b中，至少满足下列的一项：
4.根据权利要求1所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤c中，至少满足下列的一项：
5.根据权利要求1所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤c中，所述将混合菌液和生物炭制备为微生物小球的具体步骤为：将混合菌液进行离心后弃去上清液，加入无菌生理盐水重悬后再离心，重复2～3次；然后使用无菌生理盐水将菌液浓度调节至od600为1.0～1.2，加入1.0～1.5g/l的生物炭，振荡后，加入0.2～0.3g/l的无菌海藻酸钠和0.5～0.8g/l的无菌聚乙烯醇，经搅拌、静置后，将菌液滴入无菌饱和硼酸钙溶液中，形成稳定的微球结构；微球依次经冷冻静置、过滤、洗涤和真空冷冻干燥，即得微生物小球。
6.根据权利要求1所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤c中，所述生物炭由以下方法制备得到：将生物质烘干粉碎后，于惰性气氛下，以升温速率为10～30℃/min升温至400～700℃，并保温1～4小时，进行碳化，得碳化物；将碳化物和活化剂按质量比为1：1～3混合均匀，然后于惰性气氛下，以升温速率为10～30℃/min升温至400～700℃，并保温1～4小时，进行活化，得生物炭。
7.根据权利要求1～6任一项所述的利用畜禽粪便和农林废弃物修复铬污染土壤的方法，其特征在于：步骤d中，所述土壤修复的时间为30～40天，修复过程中每天浇水保证土壤含水量为55％～60％，每隔两天翻耕。
8.用于修复铬污染土壤的微生物菌剂，其特征在于：由1号微生物菌剂和2号微生物菌剂按体积质量比为4～6ml：5g组成；
9.根据权利要求8所述的用于修复铬污染土壤的微生物菌剂，其特征在于：制备1号微生物菌剂时，至少满足下列的一项：
10.根据权利要求8所述的用于修复铬污染土壤的微生物菌剂，其特征在于：制备2号微生物菌剂时，至少满足下列的一项：
