本发明涉及一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法及其应用，属于生物检测。
背景技术：
1、结核病是由结核分枝杆菌引发的慢性传染病，在全球范围内，其是仅次于covid-19的第二大传染性杀手。近年来，伴随着抗菌药物的滥用，产生了大量耐药性结核分枝杆菌，致使结核病的诊断更加复杂，无法在黄金期内对病人及时治疗，严重影响相关疾病的防治。结核分枝杆菌对抗生素的耐药机制复杂，其中由单碱基突变诱发的耐药性获得最为常见。例如，inha基因编码烯酰基还原酶，该基因的突变会导致异烟肼与nadh的亲和力下降，从而产生耐药。这说明耐药基因突变可以通过改变药物的作用靶点或其相互作用的方式，减少药物的效果。因此，开发高特异性的单碱基突变检测方法对于结核病的防治至关重要。
2、目前针对单碱基突变的最常用的方法为二代测序技术，但其存在操作过程繁琐、耗时较长，测得结果包含大量无关序列等不足，无法应用于现场即时检测。除此之外，近年来pcr(qpcr)技术，因其具有较高的检测灵敏度和定量分析能力被大量应用于单碱基突变检测，但其反应过程涉及到逆转录和核酸扩增等步骤易发生交叉感染，且无法摆脱仪器设备进行临场检测。综上所述，现有检测方法难以满足临床上检测耐药性结核分枝杆菌的需求。
3、dna催化回路反应由于其良好的可编程性和模块化特性，已广泛应用于核酸检测领域。但是，由于碱基突变的丰度往往较低(＜1％)，以及单碱基突变对核酸结构改变的影响较少，传统的dna催化回路反应难以对微小的碱基变化进行分辨，无法支撑高灵敏和高选择性的单碱基突变检测技术的开发。因此，为了进一步提升dna催化回路反应的单碱基突变检测能力，需要对该反应系统进行进一步的调控：即通过调控吉布斯自由能，抑制探针对野生型基因片段的结合，从而增加其对低丰度单碱基突变靶标的精准识别能力。
技术实现思路
1、本发明提出的是一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法及其应用，其目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法及其应用，其具有高特异性、高灵敏度、操作简便的优点。
2、本发明的技术解决方案：
3、一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其包括：
4、s1、构建可调节dna催化回路；
5、所述可调节dna催化回路包括loop-substrate dna、blocker-rna、aux-dna和合成缓冲溶液，并通过加热褪火合成反应底物；
6、s2、提取扩增，将待测样本进行前处理获得待测基因片段，将待测基因片段或野生型基因片段加入上述dna催化回路体系中扩增得到相应扩增产物；
7、s3、配置预混反应溶液，将lbcas12a效应蛋白、引导rna、荧光报告子、与反应缓存液混合，配置成预混反应液；
8、s4、荧光信号输出，将扩增产物与预混反应液混合进行crispr-cas12a识别和切割，读取荧光信号强度得到对应的荧光数值，比较分析待测样本荧光数值与野生型荧光数值；
9、所述loop-substrate dna的序列为：
10、tggcccttatgaattggctcagctagggctacacttagtaatctacac ttagtagaaatta，其中画线区域用以形成loop结构；
11、blocker-rna的序列为：
12、uaauuucuacuaaguguagauuacuaaguguag，其中画线区域用以与loop-substratedna互补配对形成反应底物；
13、aux-dna的序列为：
14、cactcactgttggcgctggg，其中画线区域用以与loop-substrate dna互补配对形成反应底物；
15、进一步，步骤(1)所述的loop-substrate dna、blocker-rna、aux-dna碱基互补配对并形成单链状态的环状突起结构，以调控吉布斯自由能，增强对单碱基突变识别的特异性。
16、进一步，步骤(1)所述反应体系的总体积为300-500μl，包含200-800nm loop-substrate dna，300-800nm blocker-rna、300-800nm aux-dna；
17、优选步骤(1)中所述loop-substrate dna浓度为500nm，blocker-rna g4浓度为500nm、aux-dna浓度为500nm。
18、进一步，步骤(1)中所述的所述加热褪火包括在95℃下变性5min，37℃褪火15min。
19、进一步，步骤(1)所述合成缓冲液包括80-120mm tris-base,100-140mm nacl,8-15mm mgcl和80-140mm kcl。
20、进一步，步骤(2)中所述扩增体系总体积为30μl，包含2.5μl目标dna，100-600nmloop-substrate dna，200-600nm blocker-rna、200-800nm aux-dna。
21、优选步骤(2)中所述loop-substrate dna浓度为400nm，blocker-rna g4浓度为400nm、aux-dna浓度为400nm
22、进一步，步骤(3)所述预混反应溶液总体积为50μl，包括25-50nm lbcas12a效应蛋白，25-50nm引导rna，荧光报告子400-800nm，1×cas12a buffer；
23、优选步骤(3)中所述的lbcas12a效应蛋白浓度为40nm，引导rna40nm，荧光报告子800nm。
24、进一步，所述引导rna根据扩增产物进行设计，其序列为：
25、uaauuucuacuaaguguagauuacuaaguguagauuacuaa，其中划线部分序列为根据催化回路反应产物设计的识别区域，用以特异性识别扩增产物。
26、进一步，步骤(4)中所述的fam荧光基团的激发波长为480nm～50nm。
27、本发明实施基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，通过在底物dna中引入环状结构区域对dna催化回路反应的吉布斯自由能进行精准调控，使得野生基因片段无法触发催化反应，从而极大程度的避免了野生基因片段产生的背景干扰。同时利用crispr-cas12a体系高效的反式裂解活性，进一步提升该检测方法对低丰度突变靶标的响应能力。
28、本发明的有益效果：
29、(1)本发明构建的检测方法可避免野生基因片段带来的背景干扰，高特异性的检测基因单碱基突变；
30、(2)级联crispr-cas12a反应，可以进一步提升检测的灵敏度，确保对低丰度基因突变的响应能力，且无需内参校正；
31、(3)本发明具备模块化特性，通过简单的序列调整就能够对不同的靶标进行高特异性、高灵敏度检测，且成功应用于多种耐药性结核分枝杆菌的检测。
1.一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(1)中，loop-substrate dna、blocker-rna、aux-dna碱基互补配对并形成单链状态的环状突起结构。
3.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(1)中，基于合成缓冲液配置反应体系的总体积为300-500μl，包含200-800nm loop-substrate dna，300-800nm blocker-rna、300-800nm aux-dna。
4.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(1)中，所述加热褪火为在95℃下变性5min，37℃褪火15min。
5.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(1)中，所述合成缓冲液包括80-120mm tris-base、100-140mm nacl、8-15mm mgcl和80-140mm kcl。
6.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(2)中，扩增体系的总体积为30μl，包含2.5μl目标dna、100-600nm loop-substrate dna、200-600nm blocker-rna、200-800nm aux-dna。
7.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(3)中，所述预混反应液的总体积为50μl，包括25-50nm lbcas12a效应蛋白、25-50nm引导rna、400-800nm荧光报告子、1×cas12a buffer。
8.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(3)中，所述引导rna根据扩增产物进行设计，其序列为：
9.根据权利要求1所述的一种基于可调节dna催化回路构建的单碱基突变检测方法，其特征是所述步骤(4)中，荧光基团激发波长为480nm～520nm。
10.如权利要求1-9任一项所述的检测方法在检测含有单碱基突变dna的耐药细菌中的应用。
