本发明涉及新材料领域，尤其是一种新型仿生骨髓大孔水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
1、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是一种多潜能干细胞，具有广泛的研究意义和临床应用潜力。间充质干细胞具有自我更新和多潜能分化能力，可以分化成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等多种细胞类型，研究mscs的分化过程有助于理解细胞发育与分化的机制。
2、mscs来源广泛且易于获取，可以从骨髓、脂肪、胎盘等多种组织中获得，通过剥离、培养和扩增等方法获得更多可用于临床的mscs。也可作为疾病模型进行研究，探究疾病的病理机制，加深对疾病的认识。mscs具有很强的免疫调节功能，可用于治疗自体免疫性疾病、移植排斥反应等，在器官移植中的应用被认为是一种替代免疫抑制剂的有效方法，具有减少排斥反应和提高移植成功率的潜力。并且，mscs还可以促进造血干细胞的增殖和分化，提高造血功能，可以广泛应用于组织工程和再生医学领域，有助于修复和替代损伤组织、器官，为重大疾病的治疗提供新思路。
3、目前，许多研究集中在mscs的多向分化潜能和免疫调节机制上，评估mscs对疾病的治疗效果，并探索其分子调控机制。在组织工程和再生医学领域，mscs被广泛应用于骨组织、软骨组织和心肌等的修复和再生，并取得了一些初步的临床成功。mscs在临床上主要以干细胞治疗的形式出现，包括骨髓移植、脂肪组织源mscs移植等。尽管有很多关于mscs的研究，但其标准化培养方法还不成熟且存在很大差异，导致mscs在不同实验环境下的表型差异。利用水凝胶培养mscs逐渐成为发展趋势。
4、细胞培养的水凝胶是一种广泛应用于细胞生物学和生物医学研究的材料。它具有良好的生物相容性和生物相似性，能提供一个适宜的三维环境来支持细胞的生长和功能表达。大多数细胞培养水凝胶通常由天然或合成的生物材料制成，具有良好的生物相容性，不会引发明显的免疫反应。且可以通过改变成分和处理方法来调节其物理化学性质，如机械强度、毛细管效应、孔隙结构等，以适应不同细胞类型和研究需求。目前主要分为两类，天然水凝胶：基于海藻酸、明胶、琼脂等天然多糖材料制成，具有天然纤维结构和生物相容性，如明胶凝胶、海藻酸凝胶等。合成水凝胶：以聚乙二醇（peg）、聚丙烯酸（paa）等合成材料为基础，通过交联反应形成凝胶结构，如peg凝胶、paa凝胶等。
5、相比于传统的二维培养基，水凝胶可以为细胞提供更接近真实体内环境的三维结构和细胞-细胞相互作用。水凝胶提供了一个类似于细胞自然环境的三维结构，使细胞能够自由生长、扩散和相互作用。它被广泛应用于研究细胞的功能、发育过程、药物筛选以及细胞治疗等领域。且水凝胶本身可以用作组织工程材料的临床前和临床应用，如细胞支架、生物打印、人工器官等，因此人们逐渐需要更好性能的水凝胶。
6、细胞黏附情况是评估水凝胶性能的重要指标。具体情况会受到水凝胶的成分、物理性质以及细胞类型的影响。已有许多研究致力于改进水凝胶的细胞黏附率。目前常见的改善方法主要是表面改性、参考生物组织的结构和特性和添加生物活性因子，设计更具有生物相似性的水凝胶材料，以提高细胞黏附和生长效果。包括交联改性、表面修饰、蛋白涂层、离子注入等方法来改善水凝胶的细胞黏附性能。改性后的水凝胶具有更好的细胞附着性和生物相容性，提高细胞黏附率和生长活性。但表面改性可能会引入额外的化学物质或可能影响水凝胶的性能。
7、此外，增加类似骨髓的海绵结构，可以提供水凝胶更大的接触面积和渗透性，有利于细胞侵入和黏附，增加细胞附着的机会，并提供更好的营养物质和代谢废物的交换。但孔径过大可能导致细胞内部分化和聚集，影响细胞的正常生理功能。因此，制备孔径合适、分布均一的水凝胶，也是一个有待解决的问题。
8、除了细胞黏附效率外，水凝胶的软硬性质对于细胞的生长也有很大影响。细胞需要通过与基质表面的相互作用来稳定附着，而基质的硬度可以影响这种相互作用。较硬的基质可以提供更稳定的支撑和引导，使细胞能够更牢固地附着，得到足够的力学信号，防止细胞的变形和收缩。但迁移能力会有所下降，细胞在禁锢下容易进入休眠状态。软基质可能提供更好的可形变性，并允许细胞拉扯基质从而促进迁移。但也由于其无法提供足够的支持力，细胞培养过程中容易发生变形和收缩，限制了细胞的扩张和组织工程的构建。因此，理想的水凝胶基质应该有一定的模量调节空间，调节范围覆盖多种细胞生长过程中对基质的需求，尽可能还原细胞的体内生长环境。
9、骨髓作为人体中一种重要的细胞外基质，其杨氏模量变化范围0.1-40kpa，内部有支持网状结构，包括纤维蛋白、胶原蛋白和血管。这些提供细胞所需的适宜环境，细胞可以通过黏附于支持结构上，确保细胞定位和稳定。这有助于细胞之间的相互作用和信号传导。提供了细胞所需的支持和信号，对维持机体内稳态和正常生理功能至关重要。此外，骨髓还具有调节细胞生长和分化的作用。造血干细胞存在于骨髓中，在骨髓中分化成不同类型的细胞，并在成熟后释放进入循环系统。而且，骨髓中的特定蛋白质和信号分子可以与细胞表面的受体结合，触发细胞内信号通路传导，在细胞增殖和凋亡等方面发挥重要作用。
10、因此，具有骨髓生理结构特征，尽可能还原骨髓内间充质干细胞生长环境的可调控仿生骨髓水凝胶是一种有广泛应用前景的生物材料，有利于细胞黏附和生长、生物分子的扩散和供应，其在组织工程和医学领域具有重要意义。目前，关于仿生骨髓水凝胶的研究还处于起步阶段，但已经取得了一些进展。研究者们致力于改善材料的生物相容性、稳定性和功能性，提供支架结构，以支持细胞黏附和三维组织重建，促进组织生长和再生。
11、总结而言，细胞培养的仿生骨髓大孔水凝胶在细胞生物学和生物医学研究领域具有广泛的应用前景。然而，仍然需要进一步的研究和开发以提高水凝胶的模量覆盖范围、黏附性能的可调控性和稳定性，以满足不同细胞类型和研究需求的要求。
技术实现思路
1、本发明所要解决的问题是，针对上述现有技术中的缺点，提出创新方案，尤其是提供一种模量分布范围骨覆盖人体骨髓模量的变化范围、细胞黏附性能良好，且黏附性能可调控的新型仿生骨髓大孔水凝胶及其制备方法和应用。
2、为解决上述问题，本发明采用的方案如下：一种新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，由末端修饰的四臂聚乙二醇、丙烯酰胺共价键连接聚合而成，其中由丙烯酰胺聚合而成的聚丙烯酰胺作为线性高分子，末端修饰的四臂聚乙二醇作为交联分子；所述末端修饰的四臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇末端修饰具有细胞黏附特征的rgd环肽。
3、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述rgd环肽包括cys-rgdfc环肽、cys-rgdfk环肽、丙烯酸-rgdfk、丙烯酸-rgdfc中的一种或多种。
4、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述cys-rgdfc环肽和cys-rgdfk环肽是在rgdfc环肽和rgdfk环肽上修饰一个巯基（-sh）。
5、进一步，所述丙烯酸-rgdfk和丙烯酸-rgdfc是在rgdfc环肽和rgdfk环肽上修饰一个双键。
6、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7、交联分子制备：将四臂聚乙二醇-马来酰亚胺、具有细胞黏附特征的rgd环肽以摩尔比2 : 1至1 : 4 比例混合于 dmso 溶剂中，在室温条件下反应，然后依次透析去除未反应的反应物和dmso溶剂，将透析所得液体冻干，得到交联分子；
8、将制备好的交联分子和丙烯酰胺加入到葡聚糖溶剂或葡聚糖和聚乙二醇的混合溶剂中，并且加入光引发剂，经震荡葡聚糖与交联分子或者葡聚糖与聚乙二醇形成液液相分离后，在紫外条件下诱导溶解于交联分子或聚乙二醇相内的丙烯酰胺聚合，同时交联分子参与网络的交联，得到水凝胶；
9、将水凝胶浸泡于水中溶胀，溶胀过程中，水凝胶吸水溶胀，同时葡聚糖和聚乙二醇液体相向水凝胶外部扩散，待葡聚糖和聚乙二醇液体相完全被水分取代后，水凝胶内部大孔径形成，得到新型仿生骨髓大孔水凝胶。
10、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联分子占交联分子和聚乙二醇混合溶液比为 5%~100%，其中交联分子占5%时，大孔水凝胶杨氏模量为0.1kpa，占30%时，大孔水凝胶杨氏模量为25kpa。
11、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖溶剂或者葡聚糖和聚乙二醇的混合溶剂中含有透明质酸钠（ha）作为增稠剂。
12、进一步，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖与交联分子和聚乙二醇的混合溶液以体积比2: 1至1 : 2进行配比，经震荡形成液液相分离。
13、一种新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶用于生物细胞、组织和类器官的培养。
14、大孔水凝胶的孔径大小可以通过调节液液相分离中聚乙二醇液相（包括交联分子和聚乙二醇）和葡聚糖的浓度比例来调控，水凝胶内孔径大小与葡聚糖占聚乙二醇液相比成正比，葡聚糖越多孔径越大。水凝胶的力学性质可以通过调节交联点的浓度来调控，在一定范围内，交联分子在成胶混合溶液中的质量占比越高，所得到的水凝胶的模量越高。
15、新型仿生骨髓大孔水凝胶，构成水凝胶的亲水高分子骨架由末端双键修饰的四臂聚乙二醇、丙烯酰胺共价键连接聚合而成，骨髓是一种富含纤维蛋白和胶原的柔韧组织，具有一定的弹性和抗拉伸能力，能够在外力压缩作用下发生一定程度的体积变化。水凝胶中线性高分子为聚丙烯酰胺，交联分子为修饰的四臂聚乙二醇，使水凝胶的物理和化学特性与骨髓相匹配。
16、水凝胶借助葡聚糖和聚乙二醇的液液相分离，实现了水凝胶内部的大孔结构，使水凝胶的细胞载荷量大大提升，且成孔隙剂的葡聚糖和未反应的聚乙二醇可以在后续的浸泡中洗去，避免后续对细胞培养的影响。骨髓的结构具有多个尺度层次，从微观细胞水平到宏观组织水平。在构建新型仿生骨髓大孔水凝胶时，孔径的可调控性，可以进一步还原骨髓结构的多个尺度层次，并实现这些尺度的合理分布。
17、水凝胶高分子骨架的交联分子为修饰了多肽的双键四臂聚乙二醇，修饰了rgd序列，网络的可拉伸性提高了细胞的黏附效率。仿照骨髓腔内存在的网状结构，促使细胞在完成黏附后，分泌内源性细胞外基质，形成由细胞外基质和细胞支架共同组成的结构，这种结构有助于支撑血细胞生成和维持组织结构的完整性。
18、本发明的技术效果如下：
19、1、水凝胶是一种具有高水吸附性和生物相容性的3d细胞支架材料。通过在水凝胶中引入rgd（arg-gly-asp）肽序列，是一种细胞黏附蛋白的特异性结合位点。在水凝胶中引入rgdfc环肽可增强细胞与凝胶的黏附性能，促进细胞与凝胶之间的相互作用，这种黏附性能有助于细胞在凝胶中长期存活并稳定定植，可以有效地改善其在组织工程和生物医学领域的应用。本水凝胶通过不同的rgd连接策略，实现了水凝胶细胞黏附性能的调控，提高了细胞抓取rgd的效率。策略一用的是不带双键的rgdfc环肽和或rgdfk环肽，（cys-rgdfc环肽、cys-rgdfk环肽）通过巯基与马来酰亚胺的反应连接在交联分子上，接入网络交联点。策略二用的是不带巯基的rgdfc环肽和或rgdfk环肽（丙烯酸-rgdfk、丙烯酸-rgdfc），修饰有双键，利用双键和丙烯酰胺分子加成聚合，以线型分子形式接入网络。
20、2、在水凝胶中引入cys-rgdfc环肽、cys-rgdfk环肽，与细胞表面的整合素受体结合后，能够激活细胞内的信号通路，调节细胞的力学特性。可以调控细胞的黏附力和张力，影响细胞的形态、运动和代谢活性。能够促进细胞的增殖能力。提供细胞所需的适宜的细胞外基质环境，刺激细胞的生长和分裂。
21、3、相对于单调的生物培养水凝胶，本仿生骨髓大孔水凝胶模量的可调模量范围更大，覆盖人体骨髓的模量分布范围。利用亲水高分子骨架的可拉伸性，使得细胞能够拉扯改变网络结构，使生长区域周围的rgd黏附位点富集，从而促进细胞生长。仿照骨髓腔内存在的网状结构，促使细胞在完成黏附后，分泌内源性细胞外基质，形成由细胞外基质和细胞支架共同组成的结构，尽可能地维持细胞的分化干性。
22、4、本水凝胶共价交联成胶，具有较高的稳定性，可在75%乙醇下灭菌处理，并长期稳定保存。
23、5、本仿生骨髓大孔水凝胶的大孔结构可以提供细胞在内的生长空间，大孔水凝胶的不同孔径范围可以影响细胞的黏附。较大的孔径可以提供更大的接触面积和渗透性，有利于细胞侵入和黏附，并提供更好的营养物质和代谢废物通道，促进细胞的扩散和迁移。
24、6、可调节的孔径可以提供更好的细胞增殖环境，为细胞的分裂和增殖提供更多的空间和营养物质。这对于细胞扩增和组织工程来说至关重要，同时也能起到一定的机械隔离作用，避免细胞多聚，造成代谢困难。可以进一步还原骨髓结构的多个尺度层次，并实现这些尺度的合理分布。
1.一种新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，由末端修饰的四臂聚乙二醇、丙烯酰胺共价键连接聚合而成，其中由丙烯酰胺聚合而成的聚丙烯酰胺作为线性高分子，末端修饰的四臂聚乙二醇作为交联分子；所述末端修饰的四臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇末端修饰具有细胞黏附特征的rgd环肽。
2.根据权利要求1所述新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述rgd环肽包括cys-rgdfc环肽、cys-rgdfk环肽、丙烯酸-rgdfk、丙烯酸-rgdfc中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述cys-rgdfc环肽和cys-rgdfk环肽是在rgdfc环肽和rgdfk环肽上修饰一个巯基(-sh)。
4.根据权利要求2所述丙烯酸-rgdfk和丙烯酸-rgdfc是在rgdfc环肽和rgdfk环肽上修饰一个双键。
5.根据权利要求1所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求3所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联分子浓度可以在7.2mg/ml-144mg/ml之间根据需要调节，其浓度为7.2mg/ml时，大孔水凝胶杨氏模量为0.1kpa，浓度为43.2mg/ml时，大孔水凝胶杨氏模量为25kpa。
7.根据权利要求3所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖溶剂或者葡聚糖和聚乙二醇的混合溶剂中含有透明质酸钠(ha)作为增稠剂。
8.根据权利要求3所述新型仿生骨髓大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖与交联分子和聚乙二醇的混合溶液以体积比2:1至1:2进行配比，经震荡形成液液相分离。
9.一种如权利要求1所述新型仿生骨髓大孔水凝胶，其特征在于，所述新型仿生骨髓大孔水凝胶用于生物细胞、组织和类器官的培养。
