本技术涉及抗原呈递合成表面、共价官能化表面、活化t细胞及其用途。
背景技术：
1、免疫疗法提供了潜在的强大方法以成功治疗癌症。通过抗原呈递树突状细胞活化t淋巴细胞是制备用于免疫疗法的靶向肿瘤的细胞毒性t淋巴细胞的一方面。通过树突状细胞的活化可以通过使用更可重现和更好表征的技术来改善。本发明的一些实施方案包括构造成活化t淋巴细胞的修饰表面，使用这种修饰表面活化t淋巴细胞的相关方法，以及含有此类活化t淋巴细胞的组合物。
技术实现思路
1、在第一方面，提供了用于活化t淋巴细胞(t细胞)的抗原呈递表面，其包括：多个主活化分子配体，其中每个主活化分子配体包括被构造为结合至t细胞的t细胞受体(tcr)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)i类分子；和多个共活化分子配体，每个包括tcr共活化分子或辅助tcr活化分子，其中多个主活化分子配体和多个共活化分子配体中的每一个特异性结合至抗原呈递表面。在一些实施方案中，多个共活化分子配体包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比例可以为约10:1至约1:20。在一些实施方案中，多个主活化分子配体可以以每平方微米约4×102至约3×104个分子的密度设置在抗原呈递表面的至少一部分上。在其他实施方案中，多个主活化分子配体以每平方微米约5×103至约3×104个分子的密度设置在抗原呈递表面的至少一部分表面上。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是珠子的表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是晶片的表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是微流体设备的至少一个内表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是管的内表面。
2、在另一方面，提供了制备用于活化t淋巴细胞(t细胞)的抗原呈递表面的方法，其包括：使多个主活化分子与共价官能化表面的第一多个结合部分反应，所述多个主活化分子中的每一个包括被构造为结合至t细胞的t细胞受体的主要组织相容性复合体(mhc)i类分子，其中，第一多个结合部分中的每一个被构造为结合主活化分子；以及使多个共活化分子与被构造为结合共活化分子的共价官能化表面的第二多个结合部分反应，所述多个共活化分子中的每一个包括：t细胞受体(tcr)共活化分子；或辅助tcr活化分子；从而在抗原呈递表面上提供了多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是珠子的表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是晶片的表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是微流体设备的至少一个内表面。在任何这些实施方案中，抗原呈递表面可以是管的内表面。
3、在另一方面，提供了试剂盒用于制备用于活化t淋巴细胞(t细胞)的抗原呈递合成表面，包括：a.如本文所述的任何共价官能化合成表面，其包括多个非共价或共价联合的第一偶联剂；和第一修饰试剂，其包括多个构造为结合至t细胞的t细胞受体的主要组织相容性复合体(mhc)i分子，以及进一步地，其中mhc分子被构造为结合至共价官能化合成表面的多个非共价或共价联合的第一偶联剂的第一子集中的一个。在一些实施方案中，第一偶联剂可以是生物素结合剂。生物素结合剂可以是链霉亲和素。在一些实施方案中，多个mhc分子中的每一个还可以包括至少一个生物素官能团。在一些实施方案中，试剂盒还包括包含多个共活化分子的试剂，每个共活化分子被构造为结合共价官能化合成表面的非共价或共价联合的第一偶联剂的第二子集中的一个。在一些实施方案中，共活化分子可以是t细胞受体(tcr)共活化分子、辅助tcr活化分子或其任何组合。共活化分子还可以包括至少一个生物素官能团。
4、在另一方面，制备包括多个链霉亲和素或生物素官能团和至少第一多个表面封闭分子配体的共价官能化表面的方法，其中该方法包括：使中间反应性合成表面的反应性部分的至少第一子集与多个连接试剂反应，所述多个连接试剂中的每一个包括链霉亲和素或生物素；并使中间反应性合成表面的反应性部分的至少第二子集与多个表面封闭分子反应，从而提供包括至少多个链霉亲和素或生物素官能团和至少第一多个表面封闭分子配体的共价官能化合成表面。在一些实施方案中，如果连接试剂包括生物素，则该方法任选地还包括将链霉亲和素与生物素官能团非共价联合。
5、在另一方面，提供了活化t淋巴细胞(t细胞)的方法，包括：将多个t细胞与抗原呈递合成表面接触，该抗原呈递合成表面包括：多个主活化分子配体，每个包括被构造为结合至t细胞的t细胞受体的主要组织相容性(mhc)i类分子；和多个共活化分子配体，每个包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子；并培养与抗原呈递合成表面接触的多个t细胞，从而将该多个t细胞的至少一部分转化为活化t细胞。抗原呈递合成表面可以是本文所述的任何抗原呈递合成表面，例如本文所述的抗原呈递珠子、抗原呈递晶片、抗原呈递管或抗原呈递微流体设备或本文所述的任何一种方法的产物。在一些实施方案中，t细胞包括cd8+t细胞。在一些实施方案中，该方法还包括使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。在一些实施方案中，每个生长刺激性分子配体包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体包括il-21或其片段。
6、在另一方面，提供了进行抗原特异性细胞毒性测定的方法，其包括：将一个或多个靶细胞加载至微流体设备的隔离围栏中；在隔离围栏中加载一个或多个t细胞，以使一个或多个t细胞可以接触一个或多个靶细胞；将靶细胞与标记凋亡细胞的可检测标记物接触；检测靶细胞是否凋亡。在某些实施方案中，微流体设备还包括微流体通道，并且隔离围栏包括通向微流体通道的开口，使得隔离围栏流体连通至微流体通道。在某些实施方案中，多个靶细胞被加载至隔离围栏中。在其他实施方案中，将单个靶细胞加载至隔离围栏中。在某些实施方案中，将单个t细胞加载至隔离围栏中。在某些实施方案中，将单个t细胞加载至隔离围栏中。在其他实施方案中，将多个t细胞加载至隔离围栏中。在某些实施方案中，通过使靶细胞和/或t细胞流入微流体通道，然后倾斜微流体芯片并允许重力将靶细胞和/或t细胞拉入隔离围栏中，将靶细胞和/或t细胞加载至隔离围栏中。在某些实施方案中，微流体设备包括dep构造，并且dep力用于将靶细胞和/或t细胞加载至隔离围栏中。在某些实施方案中，dep力由结构化的光活化。在某些实施方案中，可检测标记物在流过微流体通道的溶液中提供，于是可检测标记物可从微流体通道扩散到隔离围栏中并与靶细胞接触。在某些实施方案中，可检测标记是酶促底物，例如胱天蛋白酶-3(caspase-3)底物。在其他实施方案中，可检测标记物是与凋亡细胞和/或凋亡小体特异性结合的标记抗体。在某些实施方案中，在使靶细胞与可检测标记物接触后2小时或更长时间(例如3、4、5、6、7或更多小时)之后，确定检测靶细胞是否凋亡。在某些实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如来自癌细胞系的细胞。在某些实施方案中，靶细胞是来自表达癌症相关或癌症特异性抗原的细胞系的细胞。在某些实施方案中，靶细胞表达与黑素瘤、乳腺癌或肺癌相关的抗原。在某些实施方案中，t细胞表达嵌合抗原受体(car)。例如，t细胞可以是car t细胞。在其他实施方案中，t细胞不表达嵌合抗原受体。例如，t细胞可以是car t细胞。在其他实施方案中，t细胞不表达嵌合抗原受体。例如，t细胞可以是治疗性内源性t细胞(etc)。
7、在另一方面，提供了治疗需要治疗癌症的受试者的方法，包括：从受试者获得多个t淋巴细胞(t细胞)；将多个t细胞与包括多个构造为结合至多个t细胞中每一个的t细胞受体的主要组织相容性复合体(mhc)i分子的抗原呈递合成表面接触，其中mhc分子包括对受试者的癌症具有特异性的抗原，并且其中抗原呈递合成表面是本文所述的抗原呈递表面或根据本文所述的方法产生；产生多个活化t细胞，其中所述活化被构造为对受试者的癌症具有特异性；将多个特异性活化t细胞与未活化细胞相分离；以及，将多个抗原特异性活化t细胞引入受试者。在一些实施方案中，抗原呈递表面是本文所述的抗原呈递珠子、抗原呈递晶片、抗原呈递管或抗原呈递微流体设备。
8、在另一方面，提供了用于活化t淋巴细胞(t细胞)的试剂盒，其包括：本文所述的抗原呈递表面。在一些实施方案中，抗原呈递表面是本文所述的抗原呈递珠子、抗原呈递晶片、抗原呈递管或抗原呈递微流体设备。
9、在另一方面，提供了用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒，其包括：微流体设备(例如，具有微流体通道和隔离围栏的微流体设备)；和用于检测细胞凋亡的试剂。在某些实施方案中，微流体设备是抗原呈递微流体设备。微流体设备或抗原呈递微流体设备可以是本文所述的任何微流体设备或抗原呈递微流体设备。在某些实施方案中，用于检测细胞凋亡的试剂是胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-3)的底物。在某些实施方案中，用于检测凋亡的试剂与凋亡细胞特异性结合，例如凋亡特异性抗体。
10、在另一方面，提供了一种共价官能化合成表面，其包括至少一种多个链霉亲和素官能团和至少一种多个表面封闭分子配体，其中多个表面封闭分子配体共价附接至共价官能化合成表面，并且链霉亲和素官能团(i)共价附接至共价官能化合成表面或(ii)通过共价附接至共价官能化合成表面的生物素部分而非共价附接至共价官能化合成表面。在一些实施方式中，共价官能化合成表面可以是共价官能化珠子、共价官能化晶片或共价官能化微流体设备，如本文所述。
1.用于活化t淋巴细胞(t细胞)的抗原呈递表面，其包括：
2.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述tcr共活化分子与所述辅助tcr活化分子的比例为约20:1至约1:20。
3.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述多个主活化分子配体以每平方微米约4×102至约3×104个分子的密度设置在所述抗原呈递表面的至少一部分表面上。
4.权利要求1的抗原呈递表面，其还包括多个表面封闭分子配体。
5.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述多个共活化分子配体以每平方微米约5×103至约2×104个分子的密度或以约5×103至约1.5×104个分子的密度设置在所述抗原呈递表面的至少一部分表面上。
6.权利要求1的抗原呈递表面，其中存在于所述抗原呈递表面上的主活化分子配体与共活化分子配体的比例为约1:10至约2:1、约1:5至约2:1、约1:2至约2:1、约1:10至约1:1、约1:5至约1:1、约1:1至约2:1，或约1:2约1:1。
7.权利要求1的抗原呈递表面，其中：
8.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述多个主活化分子配体中的每一个非共价结合至结合部分，并且进一步地，其中所述结合部分(i)共价结合至所述抗原呈递表面或(ii)非共价结合至与所述表面共价结合的第二结合部分。
9.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述mhc分子包括mhc蛋白序列和β微球蛋白。
10.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述mhc分子还包括肿瘤相关抗原。
11.权利要求10的抗原呈递表面，其中所述肿瘤相关抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。
12.权利要求1的抗原呈递表面，其中：
13.权利要求1的抗原呈递表面，其中：
14.权利要求4的抗原呈递表面，其中所述多个表面封闭分子配体中的每一个包括聚乙烯(peg)部分、羧酸部分或其组合。
15.权利要求1的抗原呈递表面，其中所述多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比例为约3:1至约1:3。
16.权利要求1至15中任一项的抗原呈递表面，其中所述抗原呈递表面是珠子的表面。
17.制备用于活化t细胞(t细胞)的抗原呈递表面的方法，包括：
18.权利要求17的方法，其中，所述tcr共活化分子与所述辅助tcr活化分子的比例为约20:1至约1:20。
19.权利要求17的方法，其还包括使多个表面封闭分子与所述共价官能化表面的第三多个结合部分反应，其中所述第三多个结合部分中的每一个被构造用于结合所述表面封闭分子。
20.权利要求17的方法，其中所述mhc分子包括蛋白质序列和β微球蛋白。
21.权利要求17的方法，其中包括mhc分子的多个主活化分子中的每一个还包括肿瘤相关抗原。
22.权利要求17的方法，其中所述肿瘤相关抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。
23.权利要求17的方法，其中所述共价官能化表面的第一多个结合部分中的每一个包括链霉亲和素或生物素部分。
24.权利要求17的方法，其还包括通过使中间反应性表面的反应性部分的至少第一子集与各自包括结合部分的第一连接试剂反应来产生包括所述第一多个结合部分的共价官能化表面。
25.权利要求24的方法，其中所述结合部分是链霉亲和素或生物素，任选地，其中如果所述结合部分是生物素，则所述方法还包括将所述生物素与链霉亲和素非共价结合。
26.权利要求17的方法，其中所述第二多个结合部分是所述至少第一多个结合部分的第二子集。
27.权利要求19的方法，其中被构造为结合所述表面封闭分子的所述第三多个结合部分是所述中间反应性表面的反应性部分的另一子集。
28.权利要求17-27中任一项的方法，其中所述抗原呈递表面是珠子的表面。
29.活化t淋巴细胞(t细胞)的方法，包括：
30.活化t淋巴细胞(t细胞)的方法，包括：
31.权利要求30的方法，其中，所述t细胞包括cd8+t细胞。
32.权利要求30的方法，还包括使所述多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。
33.权利要求32的方法，其中，每个所述生长刺激性分子配体包括生长因子受体配体。
34.权利要求33的方法，其中所述生长因子受体配体包括il-21或其片段。
35.权利要求30的方法，其中与所述抗原呈递合成表面接触的培养进行约4天至约7天的时间。
36.根据权利要求30的方法，还包括：
37.权利要求36的方法，其中所述第二抗原呈递表面是多个珠子的表面，并且所述方法还包括以1:1的比例将所述第二多个抗原呈递珠子添加到所述多个活化t细胞中。
38.权利要求30的方法，其中所述活化t细胞是cd45ro+。
39.权利要求30的方法，其中所述活化t细胞是cd28阳性的。
40.权利要求30的方法，其中所述抗原呈递表面是珠子的表面。
41.权利要求40的方法，其中所述多个t细胞以抗原呈递珠子与细胞的比例为约1∶1接触抗原呈递珠子。
42.活化t细胞群，包括通过权利要求30的方法产生的产物t细胞。
43.治疗需要治疗癌症的受试者的方法；包括：
44.权利要求43的方法，其中分离所述多个抗原特异性活化t细胞还包括检测抗原特异性活化t细胞的表面生物标记物。
45.权利要求44的方法，其中所述表面生物标记物是cd45ro+或cd28+。
46.权利要求43的方法，其还包括快速扩增所述抗原特异性活化t细胞以提供扩增的抗原特异性活化t细胞群。
47.权利要求46的方法，其中在将所述特异性活化t细胞与所述未活化t细胞分离之后进行所述快速扩增。
48.权利要求43的方法，其中所述治疗受试者的方法延迟或停止受试者中癌症的进展。
49.权利要求43的方法，其中所述抗原呈递表面是珠子的表面。
50.用于制备用于t淋巴细胞(t细胞)的抗原特异性活化的共价修饰的合成表面的试剂盒，包括：
51.权利要求50的试剂盒，其中，所述多个mhc分子中的每一个还包括至少一个生物素官能团。
52.权利要求50的试剂盒，其还包括包含多个共活化分子的试剂，每个共活化分子被构造为结合至所述共价官能化合成表面的多个链霉亲和素官能团的第二子集中的一个，其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。
53.权利要求48的试剂盒，其中，所述多个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子的第一子集和辅助tcr活化分子的第二子集。
54.权利要求49的试剂盒，其中容纳包括多个共活化分子的试剂的容器容纳的多个共活化分子配体的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比例为约20:1至约1:20。
55.权利要求50的试剂盒，其还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。
56.权利要求50的试剂盒，其中所述细胞因子包括il-21或其片段。
57.权利要求50-56中任一项的试剂盒，其中所述共价官能化合成表面是珠子的表面。
58.制备包括多个链霉亲和素或生物素官能团和至少第一多个表面封闭分子配体的共价官能化表面的方法，其中所述方法包括：
59.在微流体设备内进行抗原特异性细胞毒性测定的方法，包括：
60.用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒，包括：
