本发明涉及本发明涉及雪莲培养物发酵，具体说是一种含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法。
背景技术：
1、雪莲培养物中含有大量类黄酮物质，其含量高达17.5％，而圣草酚为雪莲类黄酮中的主要活性物质，主要含量为10.13％，但黄酮类化合物的强反应活性使它们对一些环境参数非常敏感，如光照、ph值、温度、溶剂性质、是否存在金属离子和氧化剂等。类黄酮的稳定性与其化学性质(亚类和取代基)高度相关。从结构上来看，黄酮的c3位因为没有羟基取代，黄酮对光暴露的稳定性要高于黄酮醇，它们的降解过程有很大的不同。此外，大多数黄烷酮类化合物的溶解度较差，使它们的制剂过程高度复杂化，限制了其生物利用度。
2、类黄酮糖苷化合物传统制备方法为植物提取法，但是植物中类黄酮糖苷化合物含量低，需要大面积种植才能满足工业化需求，其萃取工艺复杂，需要大量的有机溶剂，且天然产物成分复杂，目标产物很难得到有效分离。
3、类黄酮的工业化应用因其稳定性、溶解性和生物利用度低而受到限制。通常采用化学法、酶法以及化学-酶法对类黄酮进行改性，改善其理化性质，增强生物利用度，但化学法具有污染性，难以在食品行业中应用。
4、绝大多数酶的化学本质都是蛋白质，其最大的缺点就是不稳定，分为化学不稳定和物理不稳定两种形式；其中化学不稳定是由于氨基酸残基的修饰或变化引起的，物理不稳定主要涉及由酸、碱、热及有机溶剂引起的蛋白质的二级、三级和四级结构的变化。同时，某些物质能够作为激活剂使酶的活性增强，某些物质能够作为抑制剂使酶的活性降低；面对种种问题，生物酶需要不断加强基础理论研究，大力投资开发新型创新产品。改善回收率、生产率、稳定性的不良现状。
5、本研究利用生物信息学手段筛选高效率转化生成圣草酚7-o-葡萄糖苷的黄烷酮7-o-葡萄糖基转移酶，以雪莲培养物中的圣草酚为底物，利用合成生物学技术改造酿酒酵母合成圣草酚7-o-葡糖苷，并通过代谢工程手段提高圣草酚7-o-葡糖苷的产量和转化效率，提高类黄酮o-苷以增强生物利用度的同时强化雪莲培养物水在解酒速度及酒精性肝损伤后的修复功能。
6、类黄酮o-苷化合物的理化性质和生物学活性已被广泛研究，在医药、化妆品和食品行业有着巨大的潜力。许多研究报告和专利强调了它们的特性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗肥胖、抗糖尿病、抗癌、神经保护、心脏保护等。
7、雪莲培养物的含有众多的活性物质，因此其具备抗氧化、免疫调节、调节血脂、抗辐射等功效，但雪莲培养物解酒护肝的作用机制尚未研究透彻；
8、亚临界萃取技术又称低温低压高效萃取技术，溶剂在高于其沸点但低于临界温度的温度区间内，在一定压力下以液态存在的状态称为溶剂的亚临界状态。在此状态下利用其相似相溶的物理性质。用做生物成份萃取的溶剂为亚临界萃取溶剂，其萃取工艺称为亚临界萃取工艺。
9、双水相萃取技术是利用待萃取物质在两相间的选择性适配，由于两相性质不同，萃取物质进入两相介质的表面性质、化学键的不同，也就导致两相中赋存萃取物质的浓度发生了变化。作用机理主要是两相溶质憎水程度存在不同时，就会分离出两水相体系，出现相分离效果，同时憎水性差异越大，分离速率越快或分离越容易。
10、cn101041653a“一种提取与富集雪莲总黄酮的方法”中提及到的工艺与本发明有着相似之处，其主要工艺在于先用超临界萃取去除非极性脂溶性物质，再用常规有机萃取提取雪莲黄酮，后经大孔树脂吸附洗脱后浓缩制的雪莲提取物，与本发明相比，其超临界萃取工艺的温度要高于亚临界萃取，黄酮类活性物质具有强抗氧化性，对温度敏感，长时间的高温会对其含量抗氧化活性产生巨大负面影响，其第二步的常规有机萃取存在着明显弊端，一般有机萃取体系中水溶液界面张力可达1×10-3-2×10-2n/m，而对于双水相萃取体系的界面张力通常只有10-6-10-4n/m。本发明由于是两水相的分离提取过程，两相张力小，可直接于后续分离工序衔接，所得醇相进行蒸馏脱醇后直接配置成雪莲培养物水，而相似专利中得后续需要大量时间得吸附和洗脱工艺，不易于产业化。
11、本文中的前处理手段与cn110066313a有着相似之处，但本发明的核心为对圣草酚进行糖苷化处理，以增强雪莲培养物解酒护肝功效。
12、而本发明将雪莲培养物中圣草酚进行糖苷化转为圣草酚7-o-葡糖苷后，其解酒护肝功效得到强化，对酒精性肝损伤的修复速度提升8倍，因此雪莲培养物对酒精性肝损伤的修复能力与本发明中将类黄酮转化为类黄酮o-苷有着密切关联。
技术实现思路
1、为解决现有技术中提到的至少一部分技术问题，本发明提供了一种含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法。
2、本发明采用的技术方案为：一种含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，s1提纯：以雪莲培养物为原料，通过亚临界流体萃取去除非极性脂溶成分；通过双水相萃取分离多糖；
3、s2：制备工程菌感受态细胞；
4、s3重组表达载体的构建：将黄烷酮7-o-葡萄糖基转移酶(uf7gt)核苷酸序列按照工程菌对编码氨基酸密码子偏爱性进行优化，以密码子适应指数(codon adaptationindex,cai)表示，以优化后的cdna为模板，通过pcr扩增得到拟uf7gt基因的puc57载体，构建pet-28a(+)-atgt质粒，转化得到工程菌；
5、s4发酵：将工程菌1％-5％接种到含有萃取后的雪莲培养物溶液中，雪莲培养物溶液浓度为25g/100ml,添加0.1-0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)的诱导剂，控制诱导温度16-22℃、诱导发酵时间12-48h即可。
6、进一步地，所述s1中亚临界流体萃取过程为：
7、将雪莲培养物粉原料装入萃取釜中,丙烷从溶剂罐下部经溶剂泵送至预热器加热到设定温度后,从萃取釜底部自下而上流过原料床层,把雪莲培养物中的脂肪酸及小分子萜类等萃取出来,再经压力控制阀减压至室温下丙烷的饱和蒸汽压,进入分离器实现丙烷与蛋黄油的分离,分离器温度控制在60-90℃，丙烷蒸汽经冷却器冷凝冷却至室温后进入溶剂罐循环使用，控制萃取温度35-42℃，萃取压力0.7-1.3mpa，萃取时间20-55min，液体丙烷流量0.78-2.78kg/h；
8、所述s1中选择无水乙醇，磷酸氢二钾和纯水构建双水相体系。
9、进一步地，所述萃取压力1.1mpa、温度39℃、萃取时间25min、丙烷流量2.21kg/h。
10、进一步地，所述亚临界流体为丙烷、丁烷、正己烷、二甲醚、四氟乙烷中的一种。
11、进一步地，所述双水相萃取过程为：选择无水乙醇，磷酸氢二钾和纯水构建双水相体系，分别加入无水乙醇60-80ml，磷酸氢二钾3-11g及经亚临界丙烷萃取后的雪莲培养物，后用纯水定容至100ml,记录上下相体积，充分混匀双水相体系，然后在50℃振荡水浴内提取5-25min，提取结束后离心分离。
12、进一步地，所述无水乙醇80ml，磷酸氢二钾7g，提取时间10min。
13、进一步地，所述s2的具体方法为：
14、(1)从-80℃医用低温保存箱中取出菌种划板，置于37℃，过夜培养；
15、(2)挑取单个菌落转接至12ml lb中，38℃振荡培养过夜。
16、(3)接种0.6ml菌液到250ml lb培养基中，37℃，220rpm振荡培养至od600为0.2-0.4之间；
17、(4)加入81ml(1/3体积)预冷的cacl2溶液彻底悬浮菌体；
18、(5)用20ml预冷的cacl2溶液悬浮菌体，加入1.12ml dmso；
19、(6)取100μl分装于预冷的1.5ml离心管中，液氮速冻，-80℃保存。
20、进一步地，所述s3的具体方法为：
21、(1)复苏：从-80℃医用低温保存箱中取出菌种保藏管，解冻，涂布器划线于相应抗性的lb平板上，37℃静置，过夜培养；
22、(2)制备种子液：挑取lb固体培养基生长的单菌落,接种至5ml相应抗性的lb液体培养基中,37℃、220rpm恒温摇床生长12h；
23、(3)扩大培养：取3％种子液接种至10ml含有相应抗生素的tb培养基中，37℃，220rpm培养至od 600＝0.6；
24、(4)诱导表达：当od 600达到0.6时，加入0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、经过萃取后的雪莲培养物溶液，23℃，220rpm培养24h。
25、进一步地，所述黄烷酮7-o-葡萄糖基转移酶(uf7gt)来源为拟南芥、穿心莲、金柑、美洲葡萄、及光紫黄芩中的一种或多种。
26、进一步地，所述工程菌为酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、谷氨酸棒状杆菌和解脂酵母中的一种或多种。
27、本发明的优点：
28、雪莲培养物含有众多活性物质，其中大部分难以水溶，或水溶性较差，制成雪莲培养物水后存在大量沉淀，因此去除沉淀、保留活性物质也是制备富含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水不可或缺的工艺步骤，需要去除非极性脂溶成分；雪莲培养物中的极性多糖对黄酮类化合物进行糖基化修饰过程的转化率有着严重影响，因此还是需要去除其中多糖成分；本发明首选运用亚临界丙烷联合双水相萃取对雪莲培养物进行前处理，去除非极性脂溶性物质及影响圣草酚进行糖基化修饰过程转化率的极性多糖成分；
29、本发明通过构建异源表达圣草酚7-o-葡萄糖苷酿酒酵母工程菌，以发酵的方式促进雪莲培养物中圣草酚糖基化，转化为生物利用度更高的圣草酚7-o-葡萄糖苷。以基因工程、代谢工程手段提高雪莲培养物中圣草酚7-o-葡萄糖苷含量，且此本发明构建的异源表达为定向表达，提高圣草酚糖基化转化率的同时不影响雪莲培养物其他活性成分。同时本发明的前处理方式可有效分离不可溶成分，因此本发明制备的雪莲培养物水不仅澄清度高，货架期长，且有显著的解酒护肝能力。且菌种可重复利用，无需重复构建，容易操作。
30、微生物异源合成天然产物不仅能解决糖基化成本高、污染性强的问题且具有生产周期短、容易操作、大规模生产等优势。
1.一种含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：包括以下步骤
2.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述s1中亚临界流体萃取过程为：
3.根据权利要求2所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述萃取压力1.1mpa、温度39℃、萃取时间25min、丙烷流量2.21kg/h。
4.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述亚临界流体为丙烷、丁烷、正己烷、二甲醚、四氟乙烷中的一种。
5.根据权利要求2所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述双水相萃取过程为：选择无水乙醇，磷酸氢二钾和纯水构建双水相体系，分别加入无水乙醇60-80ml，磷酸氢二钾3-11g及经亚临界丙烷萃取后的雪莲培养物，后用纯水定容至100ml,记录上下相体积，充分混匀双水相体系，然后在50℃振荡水浴内提取5-25min，提取结束后离心分离。
6.根据权利要求5所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述无水乙醇80ml，磷酸氢二钾7g，提取时间10min。
7.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述s2的具体方法为：
8.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：
9.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述黄烷酮7-o-葡萄糖基转移酶来源为拟南芥、穿心莲、金柑、美洲葡萄、及光紫黄芩中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的含圣草酚7-o-葡糖苷的雪莲培养物水的制备方法，其特征在于：所述工程菌为酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、谷氨酸棒状杆菌和解脂酵母中的一种或多种。
