本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物、其制备方法及多重细菌检测方法。
背景技术：
1、食源性疾病是我国乃至世界上重要的公共卫生问题，因其复杂性和严重性使其成为全球范围内的关注焦点。食源性病原体在食品中的存在和传播对公共健康构成了潜在威胁，可能引发从轻微不适到严重疾病甚至死亡等一系列健康问题；并且食源性细菌种类繁多，常见的包括沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等。据估计，金黄色葡萄球菌每年在美国造成约240000例食源性疾病；而世界卫生组织公布的数据显示，作为常见的食源性致病菌的沙门氏菌，全球每年有超过1亿人感染。沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等食源性细菌的存在使得食品安全管理面临着严峻挑战。尽管传统的检测方法包括培养法、生化检测、免疫学方法和计数法在食品安全监测中发挥着重要作用，但它们存在着一些局限性，包括消耗时间长、检测灵敏度差以及难以区分细菌毒株等。因此，需要更加先进、高效的检测技术来弥补这些不足之处，为食品安全监管提供更多的手段和保障。
2、表面增强拉曼散射(sers)光谱作为一种结合纳米技术和光学技术的超灵敏的分析工具，在食品安全领域的应用备受关注，特别是在微生物污染的检测和鉴定方面具有潜在的应用前景。它基于拉曼散射的原理，通过纳米结构表面的局域电磁场增强效应和化学增强效应，能够实现对分子的高灵敏度检测。其中，拉曼报告信号分子修饰的金属纳米颗粒通常被用作sers探针，这些纳米颗粒可以与目标微生物如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等特异性结合，形成复合物并在其存在的情况下聚集，从而产生新的sers热点，进而显著增强拉曼信号，实现对微生物的高灵敏度检测。作为一种特异性结合到目标分子或细胞表面受体的分子(抗体、核酸或多肽)，适配体可以提高对病原微生物的特异性靶向识别，为实现对目标生物分子或细胞的高灵敏度检测发挥重要作用。因此，sers技术结合适配体修饰的纳米材料的制备和功能化，为食品中微生物的快速检测提供了一种高效且敏感的解决方案，有望为加强食品质量监管和保障公众健康提供有力支持。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物、其制备方法及多重细菌检测方法。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、合成接枝适配体1的捕获探针：
4、s1-1、采用溶剂热法合成fe3o4纳米粒子；
5、s1-2、合成氨基化fe3o4纳米粒子：
6、将步骤s1-1得到的fe3o4纳米粒子分散在无水乙醇中，超声分散，然后加入aptes，加热下搅拌并回流，产物洗涤后干燥，得到氨基化fe3o4纳米粒子；
7、s1-3、合成aunps@fe3o4纳米粒子：
8、将步骤s1-2得到的氨基化fe3o4纳米粒子加入无水乙醇中，然后加入haucl4溶液，超声处理，产物洗涤、干燥，得到aunps@fe3o4纳米粒子；
9、s1-4、接枝适配体1：
10、利用步骤s1-3合成的aunps@fe3o4纳米粒子制备aunps@fe3o4溶液，与适配体1一同加入pbs溶液中混合均匀，所得混合物在-20℃下孵育，然后在室温下解冻，得到捕获探针：aptamer1@aunps@fe3o4；
11、s2、合成接枝适配体2的检测探针：
12、s2-1、合成银纳米粒子：
13、s2-2、接枝适配体2：
14、利用步骤s2-1合成的银纳米粒子制备agnps溶液，与适配体2一同加入到pbs溶液中混合均匀，所得混合物在-20℃下孵育，然后在室温下解冻，得到检测探针：aptamer2@agnps；
15、其中，适配体1和适配体2均为对目标细菌具有特异性结合作用的核酸序列；
16、根据待检测的目标细菌，选择对应的适配体1、适配体2合成得到特定的捕获探针和检测探针，然后与特定的拉曼信号分子组合为一个纳米材料组，以用于目标细菌的检测；该用于多重细菌检测的纳米材料组合物包括至少一个所述纳米材料组。
17、优选的是，步骤s1-1具体为：
18、将pssma粉末在搅拌下溶解于乙二醇中，直到溶液达到透明；随后，依次加入fecl3·6h2o、乙酸钠、氢氧化钠，形成均匀的溶液，然后转移至将高压反应釜中，在180-220℃下反应5-20h。反应结束后冷却至室温，产物用去离子水和乙醇交替进行3-10次磁分离，得到fe3o4纳米粒子。
19、优选的是，步骤s2-1具体为：
20、将葡萄糖和pvp溶解在超纯水中，80-120℃下反应2-10min，得到混合溶液；将硝酸银水溶液加入到该混合溶液中，孵育5-20min，搅拌反应1.5-6h；反应结束后产物在15000-60000rpm下离心15-60min，固体产物洗涤，过滤、干燥，得到银纳米粒子。
21、优选的是，所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法包括以下步骤：
22、s1、合成接枝适配体1的捕获探针：
23、s1-1、采用溶剂热法合成fe3o4纳米粒子：
24、将0.55g pssma粉末在搅拌下溶解于20ml乙二醇中，直到溶液达到透明；随后，依次加入0.54g fecl3·6h2o、1.0g乙酸钠、0.2g氢氧化钠，形成均匀的溶液，然后转移至将高压反应釜中，在200℃下反应10h。反应结束后冷却至室温，产物用去离子水和乙醇交替进行6次磁分离，得到fe3o4纳米粒子；
25、s1-2、合成氨基化fe3o4纳米粒子：
26、将步骤s1-1得到的fe3o4纳米粒子分散在100ml无水乙醇中，超声处理15min，然后加入0.4ml aptes，80℃下搅拌并回流24小时，产物用去离子水洗涤后在40℃下干燥至恒重，得到氨基化fe3o4纳米粒子；
27、s1-3、合成aunps@fe3o4纳米粒子：
28、将步骤s1-2得到的氨基化fe3o4纳米粒子加入20ml无水乙醇中，然后加入0.5ml浓度为0.5g/ml的haucl4溶液，在超声15min，产物用去离子水和乙醇交替洗涤，60℃下干燥至恒重，得到aunps@fe3o4纳米粒子；
29、s1-4、接枝适配体1：
30、利用步骤s1-3合成的aunps@fe3o4纳米粒子制备得到100μl浓度为5mg ml-1的aunps@fe3o4溶液，与32μl浓度为10μm的适配体1溶液一同加入到浓度为10mm、ph 7.0的pbs溶液中混合均匀，所得混合物在-20℃下孵育1小时，然后在室温下解冻，得到捕获探针：aptamer1@aunps@fe3o4，4℃下储存备用；
31、s2、合成接枝适配体2的检测探针：
32、s2-1、合成银纳米粒子：
33、将1g葡萄糖和0.5g pvp溶解在50ml超纯水中，加热至100℃并保持5min，得到混合溶液；将溶解在1ml水中的0.3克硝酸银加入到该混合溶液中，并孵育10min；然后在搅拌下反应3h，反应温度为50℃；反应结束后产物在30000rpm下离心30min，固体产物用超纯水洗涤，过滤、干燥，得到银纳米粒子；
34、s2-2、接枝适配体2：
35、利用步骤s2-1合成的银纳米粒子制备200μl浓度为10mg ml-1的agnps溶液，与32μl浓度为10μm的适配体2溶液一同加入到浓度为10mm、ph 7.0的pbs溶液中混合均匀，所得混合物在-20℃下孵育1小时，然后在室温下解冻，得到检测探针：aptamer2@agnps，4℃下储存备用；
36、根据待检测的目标细菌，将特定的捕获探针、检测探针、拉曼信号分子组合为一个纳米材料组，然后通过拉曼信号检测实现目标细菌的检测。
37、优选的是，其中，用于大肠杆菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
38、5′-sh-tggtcgtggtgaggtgcgtgtgtatgggtggtggatgagtgt gtggc-3′；对应的捕获探针记为aptamer1-1@aunps@fe3o4；
39、适配体2的序列为：
40、5′-sh-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggggggggggggtggttggctcccgtat-3′；对应的检测探针记为aptamer2-1@agnps；
41、对应的拉曼信号分子为4-罗丹明6g。
42、优选的是，其中，用于金黄色葡萄球菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
43、5′-sh-gcaatggtacggtacttcctcggcacgttctcagtagcgctc gctggtcatcccacagctacgtcaaagtgcacgctactttgctaa-3′；对应的捕获探针记为aptamer1-2@aunps@fe3o4；
44、适配体2的序列为：
45、5′-sh-gcaatggtacttccacttaggtcgaggttagtttgtcttgctg gcgcatccactgagcgcaaaagtgcacgctactttgctaa-3′；对应的检测探针记为aptamer2-2@agnps；
46、对应的拉曼信号分子为4，6-二氨基-2-巯基嘧啶。
47、优选的是，其中，用于铜绿假单胞菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
48、5′-sh-ataccagcttattcaattcccccgttgctttcgcttttcctttc gcttttgttcgtttccctgcttcctttctctgagatagtaagtgcaatct-3′；对应的捕获探针记为aptamer1-3@aunps@fe3o4；
49、适配体2的序列为：
50、5′-sh-tagggaagagaaggacatatgat-3′；对应的检测探针记为aptamer2-3@agnps；
51、对应的拉曼信号分子为普鲁士蓝。
52、优选的是，其中，用于鼠伤寒沙门氏菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
53、5′-sh-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga-3′；对应的捕获探针记为aptamer1-4@aunps@fe3o4；
54、适配体2的序列为：
55、5′-sh-tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3′；对应的检测探针记为aptamer2-4@agnps；
56、对应的拉曼信号分子为1，4-二苯基丁二炔。
57、本发明的第二方面，提供一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物，包括以下四种纳米材料组中的至少一种：
58、用于检测大肠杆菌的纳米材料组：权利要求5所述的aptamer1-1@aunps@fe3o4、aptamer2-1@agnps及4-罗丹明6g；
59、用于检测金黄色葡萄球菌的纳米材料组：权利要求6所述的aptamer1-2@aunps@fe3o4、aptamer2-2@agnps及4，6-二氨基-2-巯基嘧啶；
60、用于检测铜绿假单胞菌的纳米材料组：权利要求7所述的aptamer1-3@aunps@fe3o4、aptamer2-3@agnps及普鲁士蓝；
61、用于检测鼠伤寒沙门氏菌的纳米材料组：权利要求8所述的aptamer1-4@aunps@fe3o4、aptamer2-4@agnps及1，4-二苯基丁二炔。
62、本发明的第三方面，提供一种基于拉曼信号的多重细菌检测方法，其通过如上所述的纳米材料组合物进行检测，该方法具体为：
63、根据待测样品中所需检测的目标细菌，选择至少一个纳米材料组，满足的条件为：所选纳米材料组中至少包含能够检测目标细菌的纳米材料组；
64、将选择的纳米材料组中的捕获探针与待测样品混合孵育，然后磁分离，所得磁性物质用去离子水清洗，然后与纳米材料组中的检测探针混合孵育，所得产物中加入纳米材料组中的拉曼信号分子，检测拉曼信号，根据拉曼特征峰判断待测样品中是否含有目标细菌：当存在与目标细菌对应的拉曼特征峰时，判断存在目标细菌，反之判断不存在目标细菌。
65、优选的是，该方法具体为：
66、根据待测样品中所需检测的目标细菌，选择至少一个纳米材料组，满足的条件为：所选纳米材料组中至少包含能够检测目标细菌的纳米材料组；
67、将选择的纳米材料组中的捕获探针与100μl的待测样品混合孵育20分钟，然后磁分离，所得磁性物质用去离子水清洗，然后与纳米材料组中的检测探针混合孵育10分钟，所得产物中加入纳米材料组中的拉曼信号分子，检测拉曼信号，根据拉曼特征峰判断待测样品中是否含有目标细菌：当存在与目标细菌对应的拉曼特征峰时，判断存在目标细菌，反之判断不存在目标细菌；
68、其中，捕获探针的加入量为100μl、浓度为5mg/ml，检测探针的加入量为100μl、浓度为5mg/ml，拉曼信号分子的加入量为50μl、浓度为1mm。
69、在进行检测时，根据具体的目标细菌，可以至采用一种纳米材料组，也可以选择多种。例如，若目标细菌只有1种，那选择与之对应的一种纳米材料组进行拉曼检测即可；若目标细菌只有4种，那可将4种纳米材料组混合加入，进行拉曼检测。
70、优选的是，其中，大肠杆菌对应的拉曼特征峰位置为1370.6，1525.4和1668.6cm-1中的任意一个；
71、金黄色葡萄球菌对应的拉曼特征峰位置为919.3、559.7和609.3cm-1中的任意一个；
72、铜绿假单胞菌对应的拉曼特征峰位置为2126.7、2158.9和2185.6cm-1中的任意一个；
73、鼠伤寒沙门氏菌对应的拉曼特征峰位置为1557.8和1665.7cm-1中的任意一个。
74、以下对本发明中细菌的检测原理进行说明，以便于对本发明的理解：
75、带信号标记的拉曼光谱技术可以通过测量分子振动或转动能级差的特征频移来反映物质的结构和成分，从而鉴定出不同的细菌种类。本文通过采用四种不同的拉曼信号标签，结合适配体磁捕获技术，对不同细菌实现了不同拉曼信号标记，从而通过测量出不同的拉曼信号特征谱图，从而快速准确地鉴定出不同的细菌种类，实现对多重细菌的拉曼光谱检测。
76、以大肠杆菌的检测为例，采用结合适配体1：5′-sh-tggtcgtggtgag gtgcgtgtgtatgggtggtggatgagtgtgtggc-3′)的捕获探针(aptam er1-1@aunps@fe3o4)，可以通过适配体与大肠杆菌表面抗原或者外膜中的脂质相结合，从而将大肠杆菌通过简单磁分离技术，从水溶液中富集获取；当再结合搭载适配体2(5′-sh-atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggg gcgcgggggggggggggtggttggctcccgtat-3′)的检测探针(aptame r2-1@agnps)时，通过适配体2与大肠杆菌外膜蛋白的高度特异性识别，在精准靶向细菌的同时，通过测量检测探针agnps上的标记分子(r6g)的拉曼信号，可以特异性识别出大肠杆菌，并且，由于捕获探针中的anps@fe3o4与检测探针中的agnps特有的强表面等离子体共振效应，从而表现出相对较强的散射强度，进一步增强标记分子(r6g)的拉曼信号强度，实现对大肠杆菌特异的高灵敏检测。
77、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌对、鼠伤寒沙门氏菌的检测原理相同，不再赘述。其中，各个适配体1和适配体2是按照现有技术设计的序列，其具备相应的特异性捕获、识别等功能，具体参照文献如下：
78、大肠杆菌适配体1来自于文献(whole-bacterium selex of dnaaptamers forrapid detection of e.coli o157:h7 using a qcm sensor)；适配体2设计来自于文献(naked-eye based point-of-care detection ofe.coli o157:h7 by a signal-amplified microfluidic aptasensor)；
79、金黄色葡萄球菌适配体1来自于文献(asingle-particle sers biosensor usingaptamer-functionalized hierarchical gold microparticles for highly sensitiveand broad-range detection of staphylococcus aureus)，适配体2来自于文献(rapidsers identification of methicillin-susceptible and methicillin-resistantstaphylococcus aureus via aptamer recognition and deep learning)；
80、铜绿假单胞菌适配体来自于文献(aptamer-based biosensors for pseudomonasaeruginosa detection)；
81、鼠伤寒沙门氏菌适配体来自于文献(selection and characterization ofaptamers against salmonella typhimurium using whole-bacterium systemicevolution of ligands by exponential enrichment(selex))。
82、本发明的有益效果是：
83、本发明提供了一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物、其制备方法以及基于基于拉曼信号的多重细菌检测方法，本发明采用四种不同的拉曼信号分子，结合适配体磁捕获技术，与对应设计的四组探针(捕获探针、检测探针)配合，通过拉曼信号特征谱图检测与分析，能够快速准确的实现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的多重细菌，具有很好的应用前景。
1.一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，步骤s1-1具体为：
3.根据权利要求2所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，步骤s2-1具体为：
4.根据权利要求3所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，其中，用于大肠杆菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
6.根据权利要求4所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，其中，用于金黄色葡萄球菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
7.根据权利要求4所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，其中，用于铜绿假单胞菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
8.根据权利要求6所述的用于多重细菌检测的纳米材料组合物的制备方法，其特征在于，其中，用于鼠伤寒沙门氏菌检测的纳米材料组中的适配体1的序列为：
9.一种用于多重细菌检测的纳米材料组合物，其特征在于，包括以下四种纳米材料组中的至少一种：
10.一种基于拉曼信号的多重细菌检测方法，其特征在于，其通过如权利要求9所述的纳米材料组合物进行检测，该方法具体为：
11.根据权利要求10所述的基于拉曼信号的多重细菌检测方法，其特征在于，该方法具体为：
12.根据权利要求11所述的基于拉曼信号的多重细菌检测方法，其特征在于，其中，大肠杆菌对应的拉曼特征峰位置为1370.6，1525.4和1668.6cm-1中的任意一个；
