本发明涉及医药领域，特别是涉及一种检测子宫内膜容纳胚胎着床状态的试剂盒及其用途。
背景技术：
1、子宫内膜是与胚胎直接接触的母体组织，其主要功能是为胚胎并置、附着、侵入及发育成熟创建并维持最佳免疫微环境、子宫内膜容受性、内/旁分泌和分子环境。在实现这些生物功能的过程中，子宫内膜伴随性发生一系列独特且显著的适应性变化(蜕膜化)，导致内膜基质细胞在形态学与功能水平上经历细胞重编程并最终分化成为具有分泌功能的高度特化细胞类型。
2、子宫内膜免疫微环境：
3、围着床期及早孕期，蜕膜化子宫内膜存在大量免疫细胞(占比：可达细胞总数的30％-40％，分类：主要包括自然杀伤细胞，巨噬细胞，t细胞，树突状细胞及少量b细胞)，其中大多为组织原位细胞，也有一些迁移自外周循环系统，且这些免疫细胞散在分布于基质室以及功能层上皮细胞与基底层淋巴聚集区之间。功能层免疫细胞的数量、类型和激活状态高度依赖于激素环境且代表不同生物功能，如子宫自然杀伤细胞通过绒毛外滋养层细胞调控滋养层细胞侵入并增强血管重塑，巨噬细胞和树突状细胞可预防感染，调控t细胞促进母胎免疫耐受。
4、cd56是子宫内膜自然杀伤细胞的表达标记物(cd9+cd3-cd56highcd16low)。子宫自然杀伤细胞(uterine natural killer，unk)作为子宫内膜中的主要白细胞类群，其增殖与迁移可能受细胞因子、趋化因子、类固醇激素应答内膜细胞所分泌的其他生物因子以及其他免疫细胞所调控。unk细胞是先天免疫系统的关键组分，也是病毒感染和肿瘤生长的首道抵御防线，对正常子宫内膜组织的稳态平衡亦十分重要。unk细胞的主要功能是为胚胎着床和胎盘发育提供适宜环境：(1)产生并分泌血管生成因子(包括血管vegf和血管紧张肽-2)以促进子宫内膜血管成熟；(2)分泌诸如tnfα、tgfβ、il-2、lif、gm-csf、csf-1、cxcl10和cxcl12等细胞因子来调控滋养层细胞侵入并促进胎盘发育；(3)促进滋养层细胞对子宫内膜螺旋动脉的血管重塑作用；(4)调控母胎界面免疫耐受。因此，鉴于unk细胞在胚胎着床中的关键作用，其数目和功能异常与胚胎着床失败、流产、胎停、胎儿宫内发育迟缓及先兆子痫等不良妊娠结局相关。
5、cd68是子宫内膜巨噬细胞的表达标记物。巨噬细胞(macrocytes)主要位于腔上皮、功能层上皮下基质和淋巴聚集区中，包括具有促炎特性的巨噬细胞1(macrocytes 1，)与具有抗炎特性的巨噬细胞2(macrocytes 2，)两类，且两类巨噬细胞均高表达cd68。巨噬细胞在非妊娠期子宫内膜中的数量很少(巨噬细胞会在黄体期子宫内膜中数量大幅增加)，然而，伴随妊娠的出现，巨噬细胞数量会显著增至蜕膜白细胞总数的20％-25％并主要定位于入侵性滋养层细胞和螺旋动脉附近(早孕期)。作为先天及体液免疫系统中的关键效应细胞，巨噬细胞不仅识别并吞噬抗原，作为抗原呈递细胞(antigen-presentingcells，apc)激活t细胞并在组织再生中发挥作用，还通过促进囊胚着床和滋养层细胞侵入、重塑螺旋动脉、清除凋亡细胞及细胞碎片和保护胎儿免受外源病原侵害等生物过程在早孕期胚胎着床过程中发挥重要作用。
6、cd3是子宫内膜t细胞的表达标记物(t细胞特征性表达cd3受体)，而foxp3则是调控t细胞(regulatory t cells，treg cells)的表达标记物。t细胞主要位于基底层淋巴聚集区中，约占子宫内膜细胞总数的1％-2％。t细胞是适应性免疫系统的效应细胞，可通过分泌细胞因子来影响其他免疫细胞的活性。t细胞在总细胞数目中的占比异常与胚胎着床失败及流产等不良妊娠具有显著相关性。
7、调控t细胞(cd4+cd25+foxp3+)是cd4+t细胞的一个亚群，因限制免疫反应的生物功能而在适应性免疫中发挥重要作用，其参与自身及移植免疫耐受并在预防针对自身抗原的自身免疫应答中发挥相关作用。妊娠期间，调控t细胞数量增加且参与促进母胎免疫耐受：(1)预防效应性t细胞对胎儿父系抗原的免疫排斥；(2)促进母体血管适度重塑；(3)通过作用于其他白细胞与非白细胞类型来诱导蜕膜以利于胚胎着床。此外，相对于妊娠中后期，调控t细胞在围着床期与早孕期的妊娠促进效应更加显著。
8、cd20与cd138分别是子宫内膜b细胞和浆细胞(效应b细胞)的表达标记物。b细胞通过产生针对外源抗原的抗体来参与体液免疫反应，且与外源抗原相互作用并最终激活b细胞的cd9，cd22和cd20均特异性表达于b细胞。cd20+b细胞与cd138+浆细胞可反映子宫内膜炎性与浆细胞浸润状态并有助于子宫内膜炎的诊断与治疗。
9、子宫内膜容受性：
10、子宫内膜容受性，即母体子宫内膜对胚胎的接受能力，取决于胚胎和子宫内膜同步发育的复杂过程。胚胎的成功附着与侵入需要处于良好平衡状态的子宫内膜：排卵后约6天左右，子宫内膜在形态学(呈现容受性表型)及基因表达水平上(出现特异性基因表达图谱)伴随子宫内膜容受性发生变化以为接受胚胎做准备，继而出现为期4天左右的以“蜕膜化”为主要特征的“着床窗口期”(window of implantation，woi)。因此，研究子宫内膜容受性标志物在基因和蛋白水平上的变化不仅可以有效检测胚胎着床“窗口期”，还可以通过尝试针对性改善子宫内膜容受性治疗以提高胚胎着床率。
11、整合素αvβ3(integrinαvβ3)是一种介导细胞基质-粘附过程的完整膜糖蛋白，作为子宫内膜腔表面细胞粘附分子主要表达于子宫内膜上皮细胞与血管中，于月经周期第20日左右(分泌中期)开始表达并可持续至妊娠期，且时间表达模式与着床窗口期相吻合。整合素αvβ3不仅参与蜕膜化过程，还可能作为囊胚附着潜在受体并在胞饮突依赖性附着阶段初期发挥作用。此外，整合素αvβ3在子宫内膜中的显著低水平表达可能与子宫容受缺陷有关并影响胚胎着床成功率。因此，功能研究相对深入的整合素αvβ3被作为经典子宫内膜容受性指标得以广泛应用。
12、骨桥蛋白(osteopontin，opn)是一种基质糖基化磷蛋白，作为整合素αvβ3的胞外基质配体，与其受体整合素αvβ3相类似，亦是经典子宫内膜容受性生物指标。骨桥蛋白与整合素αvβ3这两种糖蛋白共定位于子宫内膜腔表面，均于着床窗口期在上皮细胞中呈现峰值表达，骨桥蛋白被分泌至子宫腔中，且可能在子宫内膜或胚胎中共同参与胚胎附着相关信号通路。
13、白血病抑制因子(lseukemia inhibitory factor，lif)是一种由子宫腺体分泌的糖蛋白，作为白介素-6家族的多效性细胞因子，主要表达于子宫内膜腔上皮与腺上皮细胞并于分泌中晚期达到表达峰值，此外，其表达时序性近乎同步于胚胎着床窗口期，而其表达空间性则定位于胚胎着床的子宫内膜区域。白血病抑制因子表达失调与不明原因不孕及胚胎着床失败呈显著相关，其参与的复杂信号通路亦为妊娠建立所必需，还作为重要的子宫内膜区域性调质在胚胎着床及相关免疫耐受过程中发挥关键作用。因此，白血病抑制因子可作为一个衡量子宫内膜容受性的理想指标。
14、同源框a10蛋白(homeobox a10，hoxa10)是一种可能参与调控基因表达、胚胎形态发生和分化的dna结合转录因子。当胚胎于窗口期着床于子宫内膜时，hoxa10蛋白编码基因受子宫腔内大量雌激素与孕激素作用而出现激活性表达，随后，定位于基质细胞核内的hoxa10蛋白通过激活或抑制下游靶基因(子宫内膜基质细胞增殖分化相关基因)的转录过程以诱导子宫内膜在结构、功能水平上的变化，进而使得子宫内膜向着良好容受性的趋势分化，也是参与胚胎着床与成熟过程的必需因子。因此，hoxa10蛋白可作为理想标记指标应用于子宫内膜容受性的综合评估。
15、目前，多数研究仍采用1-2个生物指标用于评估子宫内膜免疫微环境与容受性，然而结果并不理想。此外，还有针对子宫内膜免疫微环境与容受性相关基因的科研检测，如定制化内膜相关基因芯片，通过分析参与细胞周期、细胞粘附、细胞信号传导、外界刺激应答、免疫、循环及解剖学结构发育等重要生物学过程且在子宫免疫微环境和/或容受阶段差异性表达的编码基因，进而评估胚胎与子宫之间同步性以避免无效胚胎移植。然而，临床实践实用性、基因转录水平与蛋白产物表达水平之间尚不明确的相关性以及不菲的检测价格均显著限制了其临床应用潜质。因此，开发一种能够在围着床期子宫内膜组织上同时标记子宫内膜免疫微环境及容受性相关的多靶点分子的技术方案显得尤为重要。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测子宫内膜容纳胚胎着床状态的试剂盒及其用途，用于解决现有技术中的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测子宫内膜容纳胚胎着床状态的试剂盒，所述试剂盒包括检测子宫内膜免疫微环境中多种免疫细胞标志物的抗体以及与各抗体相匹配的荧光染料，所述免疫细胞包括自然杀伤细胞、b细胞、浆细胞、巨噬细胞、t细胞中的两种以上。
3、所述检测免疫细胞标志物的抗体包括抗cd56抗体、抗cd20抗体、抗cd138抗体、抗cd68抗体、抗cd3抗体或抗foxp3抗体中的多种。
4、在本发明的某些实施方式中，与抗cd56抗体对应的荧光染料为opal620，与抗cd20抗体对应的荧光染料为opal520，与抗cd138抗体对应的荧光染料为opal570，与抗cd68抗体对应的荧光染料为opal780，与抗cd3抗体对应的荧光染料为opal690，与抗foxp3抗体对应的荧光染料为opal480。
5、在本发明的某些实施方式中，所述试剂盒还包括检测子宫内膜容受性相关物质的抗体以及与各物质相匹配的荧光染料。
6、所述检测子宫内膜容受性相关物质的抗体包括抗整合素αvβ3抗体、抗opn抗体、抗hoxa10抗体、抗lif抗体中的任一种或多种。
7、与抗hoxa10抗体对应的荧光染料为opal 520，与抗opn抗体对应的荧光染料为opal570，与抗整合素αvβ3抗体对应的荧光染料为opal 620，与抗lif抗体对应的荧光染料为opal690。
8、本发明还提供所述试剂盒在制备检测子宫内膜容纳胚胎着床状态产品或在制备不孕诊断产品中的用途。
9、如上所述，本发明的检测子宫内膜容纳胚胎着床状态的试剂盒及其用途，具有以下有益效果：免疫荧光多重标记(multiplex immunohistochemistry,mihc)平台不仅克服了常规免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)只能在同一切片上检查有限细胞类型的少数标记物这一方法局限性，实现了在一张组织切片上多重荧光的免疫组化染色，达到同时对多靶点进行标记，还克服了传统流式细胞术(flow cytometry，fcm)只能提供子宫内膜样本中不同细胞类型之间的相对比例信息而无法提供样本中细胞共定位及空间分布关系等信息的技术限制，在精准同步检测子宫内膜免疫微环境与容受性相关多项指标的同时，进行细胞类型、指标标记物定量及细胞空间分布等系统分析，进而显著提高内膜胚胎着床“窗口期”的判读准确性，为原发不孕、反复妊娠失败/丢失及反复胚胎移植失败等生育相关疾病的诊断和治疗提供数据基础。
1.一种检测子宫内膜容纳胚胎着床状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测子宫内膜免疫微环境中多种免疫细胞标志物的抗体以及与各抗体相匹配的荧光染料，所述免疫细胞包括自然杀伤细胞、b细胞、浆细胞、巨噬细胞、t细胞中的两种以上细胞。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述t细胞选自辅助性t细胞、细胞毒性t细胞或调节性t细胞中的任一种或多种；和/或，所述检测免疫细胞标志物的抗体包括抗cd56抗体、抗cd20抗体、抗cd138抗体、抗cd68抗体、抗cd3抗体或抗foxp3抗体中的多种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下特征中的任一项或多项：
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下特征中的任一项或多项：
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测子宫内膜容受性相关物质的抗体以及与各物质相匹配的荧光染料。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测子宫内膜容受性相关物质的抗体包括抗整合素αvβ3抗体、抗opn抗体、抗hoxa10抗体、抗lif抗体中的任一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下特征中的任一项或多项：
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下特征中的任一项或多项：
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下中物质的任一项或多项：抗原修复剂、免疫组化封闭剂、二抗、抗体稀释液、清洗液、dapi染剂、封片剂、脱蜡剂、水化剂、水。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原修复液为柠檬酸盐抗原修复液；和/或，所述抗原修复液的ph为5.5～6.5；和/或，所述二抗为辣根过氧化物酶标记的igg抗体。
11.权利要求1-10任一所述的试剂盒在制备检测子宫内膜容纳胚胎着床状态产品或在制备不孕诊断产品中的用途。
