本发明涉及微生物发酵培养，具体地说，涉及一种生产缬氨酸的方法与应用。
背景技术：
1、支链氨基酸(branch chain amino acid，bcaa)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，l-缬氨酸(l-valine)，化学名称为l-α-氨基异戊酸，分子式为c5h11no2，相对分子质量为117.15。l-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/l，50℃的溶解度为96.2g/l，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。
2、l-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。l-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，l-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，l-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。l-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，l-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。
3、目前，l-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产l-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产l-缬氨酸最主要的方法。但目前l-缬氨酸发酵生产的效率仍有待提高，较难满足大规模工业化生产的需求。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种高产缬氨酸的新方法。
2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
3、一种生产缬氨酸的方法，采用微生物发酵法，其在不通气条件下进行发酵菌的种子培养和厌氧发酵，在发酵培养基中包括柠檬酸或柠檬酸盐(优选为柠檬酸)，在发酵时，采用流加碳酸盐溶液的方式进行ph控制；所述发酵菌为肠杆菌科细菌。
4、本发明所述的不通气条件下，是指从种子培养开始到发酵生产结束，整个细菌的生长和产酸过程都在不通入任何气体的条件下进行。
5、本发明发现在厌氧发酵时，于培养基配方中添加柠檬酸或其盐作为底料，并在发酵时配合流加碳酸盐溶液来调节维持ph值，可显著提高缬氨酸的产量，提升糖酸转化率，为工业生物合成缬氨酸提供了一种新的高效途径。
6、本发明的方法中，所述柠檬酸或柠檬酸盐在发酵培养基中的浓度为0.5-2.0g/l，优选为1.5-2.0g/l，更优选，在发酵培养基中包含浓度为1.5g/l柠檬酸，以获得更佳的糖酸转化率。
7、本发明的方法中，所述柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铁、柠檬酸钙中的一种或多种，优选为柠檬酸钠；
8、碳酸盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种，优选为碳酸铵或碳酸氢钠，更优选为碳酸铵，以获得更佳的糖酸转化率。
9、本发明的方法中，所述碳酸盐溶液的浓度为5-40g/l，优选为10-30g/l，更优选为20g/l，以更适于工业化生产应用。
10、本发明的方法中，所述发酵菌为埃希氏菌属大肠杆菌(escherichia coli)，优选为大肠杆菌atcc8739、大肠杆菌atcc25922或大肠杆菌atcc35150；更优选，所述发酵菌为大肠杆菌tys8789，其保藏编号为cctcc no:m 2022134。
11、大肠杆菌tys8789为大肠杆菌atcc8739来源，其构建方法参见中国专利申请号：202210248471.9(公开号cn114958888a)，拉丁学名是escherichia coli，中文名称是大肠埃希氏菌，即，大肠杆菌，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期是2022年02月18日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022134。
12、本发明的方法中，所述发酵培养基还包括：葡萄糖、mgso4·7h2o、酵母、(nh4)2so4、kh2po4、甜菜碱盐酸盐、l-丙氨酸、feso4·7h2o、cocl2·6h2o、cuso4、znso4·7h2o、na2moo4·2h2o、h3bo3和mnso4·h2o。
13、具体进行发酵培养基制备时，为了避免培养基各组分之间提前产生不希望的反应，可将发酵培养基组分分为a、b组，a组为葡萄糖和mgso4·7h2o，b组为其他组分，a、b组分别高温灭菌后在无菌条件下混合，即可获得发酵培养基。
14、优选，所述发酵培养基还包括：葡萄糖20-50g/l、mgso4·7h2o0.5-2.5g/l、酵母0.5-2.0g/l、(nh4)2so4 2.0-5.0g/l、kh2po4 1.0-3.5g/l、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/l、l-丙氨酸0.1-0.5g/l、feso4·7h2o1.0-2.5mg/l、cocl2·6h2o 0.1-0.5mg/l、cuso4 0.1-0.5mg/l、znso4·7h2o 0.1-1.0mg/l、na2moo4·2h2o 0.1-0.5mg/l、h3bo3 0.01-0.1mg/l和mnso4·h2o0.1-1.0mg/l。
15、更优选，所述发酵培养基还包括：葡萄糖30g/l、mgso4·7h2o2g/l、酵母0.5g/l、(nh4)2so4 2g/l、kh2po4 3g/l、甜菜碱盐酸盐0.5g/l、l-丙氨酸0.3g/l、feso4·7h2o 1.5mg/l、cocl2·6h2o 0.2mg/l、cuso4 0.2mg/l、znso4·7h2o 0.6mg/l、na2moo4·2h2o 0.3mg/l、h3bo3 0.08mg/l和mnso4·h2o 0.8mg/l。
16、本发明的方法中，发酵条件为：压力为0.01-0.05mpa，转速为200-500rpm，温度为37±1℃，采用流加碳酸盐溶液的方式控制ph为6.8-7.0，在葡萄糖用尽前补加葡萄糖溶液，控制发酵体系中的葡萄糖浓度为0.5-10g/l。
17、具体生产时，葡萄糖溶液的浓度可为55-65％，优选为60％(w/w)，以更利于生产控制。
18、本发明的方法中，发酵时间可为48h。
19、本发明的方法中，发酵菌的种子培养时所用的种子培养基可包括：a组分：葡萄糖和mgso4·7h2o；b组分：酵母、蛋白胨、(nh4)2so4、kh2po4、k2hpo4·3h2o；
20、b组分在灭菌前先调整ph值为7.2-7.4(可用5mol/l koh调整ph值)，之后进行灭菌，再与灭菌后的a组分在无菌条件下混合，即可获得种子培养基。
21、本发明的方法中，发酵菌的种子培养时所用的种子培养基可包括葡萄糖20-80g/l、mgso4·7h2o 0.5-2.5g/l、酵母5-10g/l、蛋白胨5-10g/l、(nh4)2so4 2.0-13.2g/l、kh2po41.0-3.5g/l和k2hpo4·3h2o1.0-5.0g/l。
22、优选，包括葡萄糖20g/l、mgso4·7h2o 1g/l、酵母10g/l、蛋白胨10g/l、(nh4)2so44g/l、kh2po4 3.0g/l和k2hpo4·3h2o 5.0g/l。
23、本发明还提供一种上述方法在提升缬氨酸的发酵糖酸转化率上的应用。
24、本发明的有益效果至少在于：
25、本发明提供的肠杆菌科细菌在添加柠檬酸或其盐作为底料，同时流加碳酸盐溶液来调节ph的条件下厌氧发酵生产缬氨酸的方法，具有缬氨酸产量明显提高的显著优势。本发明可以为发酵法生产其他氨基酸产品、核苷类产品提供借鉴。且本发明方法容易理解和实现，特别适合工业化生产。
1.一种生产缬氨酸的方法，采用微生物发酵法，其特征在于，在不通气条件下进行发酵菌的种子培养和厌氧发酵，在发酵培养基中包括柠檬酸或柠檬酸盐，在发酵时，采用流加碳酸盐溶液的方式进行ph控制；所述发酵菌为肠杆菌科细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸或柠檬酸盐在发酵培养基中的浓度为0.5-2.0g/l，优选为1.5-2.0g/l，更优选，在发酵培养基中包含浓度为1.5g/l柠檬酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铁、柠檬酸钙中的一种或多种；
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述碳酸盐溶液的浓度为5-40g/l，优选为10-30g/l，更优选为20g/l。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵菌为埃希氏菌属大肠杆菌(escherichia coli)，优选为大肠杆菌atcc8739、大肠杆菌atcc25922或大肠杆菌atcc35150；更优选，所述发酵菌为大肠杆菌tys8789，其保藏编号为cctcc no:m2022134。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括：葡萄糖、mgso4·7h2o、酵母、(nh4)2so4、kh2po4、甜菜碱盐酸盐、l-丙氨酸、feso4·7h2o、cocl2·6h2o、cuso4、znso4·7h2o、na2moo4·2h2o、h3bo3和mnso4·h2o。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括：葡萄糖20-50g/l、mgso4·7h2o 0.5-2.5g/l、酵母0.5-2.0g/l、(nh4)2so4 2.0-5.0g/l、kh2po4 1.0-3.5g/l、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/l、l-丙氨酸0.1-0.5g/l、feso4·7h2o 1.0-2.5mg/l、cocl2·6h2o0.1-0.5mg/l、cuso4 0.1-0.5mg/l、znso4·7h2o 0.1-1.0mg/l、na2moo4·2h2o 0.1-0.5mg/l、h3bo3 0.01-0.1mg/l和mnso4·h2o 0.1-1.0mg/l。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括：葡萄糖30g/l、mgso4·7h2o 2g/l、酵母0.5g/l、(nh4)2so42g/l、kh2po4 3g/l、甜菜碱盐酸盐0.5g/l、l-丙氨酸0.3g/l、feso4·7h2o 1.5mg/l、cocl2·6h2o 0.2mg/l、cuso4 0.2mg/l、znso4·7h2o0.6mg/l、na2moo4·2h2o 0.3mg/l、h3bo3 0.08mg/l和mnso4·h2o 0.8mg/l。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，发酵条件为：压力为0.01-0.05mpa，转速为200-500rpm，温度为37±1℃，采用流加碳酸盐溶液的方式控制ph为6.8-7.0，在葡萄糖用尽前补加葡萄糖溶液，控制发酵体系中的葡萄糖浓度为0.5-10g/l。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在提升缬氨酸的发酵糖酸转化率上的应用。
