本发明属于生物合成，涉及一种新型细胞色素p450酶及其用途，具体是一种能够催化dhea进行c7位和c15位羟化反应生成7α,15α-双羟基去氢表雄酮的p450酶。
背景技术：
1、甾体药物被广泛应用于抗炎、抗过敏、抗毒、调节性功能、维持生命等医疗方面，已成为仅次于抗生素的第二大类药物。目前，市场上有超过400多种甾体激素药物，每年销售额超过1000亿美元，其应用范围也越来越广泛。进一步开发新药往往需要对甾体药物的母核进行特异性修饰，其中羟基化甾体既可直接作为甾体药物、也可作为关键中间体用于合成具有更高价值的甾体药物。一般而言，甾体不同位置碳原子的羟基化产物通常表现出不同的药理活性。其中去氢表雄酮(脱氢表雄酮，dhea，cas：53-43-0)是一种重要的甾体活性物质，具有抗衰老以及蛋白同化作用，也可用于合成多种重要的甾体类药物，其羟化产物三羟基雄甾烯酮(7α,15α-dioh-dhea，亦称(3β,7α,15α)-3,7,15-trihydroxy-androst-5-en-17-one)可作为第四代口服避孕药屈螺酮(drospirenone)的重要合成中间体。
2、屈螺酮是由德国先灵(schering ag)公司开发的一种具有天然黄体酮活性的内酯类孕激素，可以用于治疗内源性黄体酮不足引起的各种疾病，具有高效、低毒、不影响脂代谢的优点。2020年，屈螺酮为美国排名第145位的最常用处方药，处方次数约480万，处方销售额约为5.63亿美元。传统的化学法合成屈螺酮需要18步反应，能耗高且收益低。而通过在dhea的c7α和c15α位点引入双羟基，得到7α,15α-dioh-dhea后再进行化学合成，可以使总反应路线缩短4步，减少环境污染并提高产物收率，这一合成路径中7α,15α-dioh-dhea的合成是关键。
3、当前工业生产上主要利用真菌作为转化菌株来生产7α,15α-dioh-dhea。但是利用真菌转化也存在时间周期长、副产物多等问题。一般而言，真菌对甾体类物质的羟基化转化可视为由真菌体内的p450酶系催化完成。近年来，随着分子生物学技术的发展，人们开始尝试从真菌中克隆p450酶基因，然后在酵母或大肠等工程菌中进行异源表达与工程化改造，以提高p450酶的表达量、对甾体的转化率以及改变p450酶对甾体羟化的立体/区域选择性等。由于真菌中含有大量的p450酶，目前尚有多种真菌来源的p450酶未确定功能并实现异源表达。而目前鉴定出的真菌来源的p450酶如cyp68jx、cypx在催化dhea生成7α,15α-dioh-dhea时存在活性不足等问题，难以实现工业应用。
技术实现思路
1、本课题组在持续进行的细胞色素p450酶种类开发和研究中，从禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)中分离出一种新型的p450酶，其基因为seq id no.2，对应的氨基酸序列为seq id no.1，其具有较高的催化去氢表雄酮(dhea)c7位和c15位羟化生成7α,15α-双羟基去氢表雄酮(7α,15α-dioh-dhea)的酶活力。通过将该酶的氨基酸序列提交至细胞色素p450国际命名委员会(http://drnelson.uthsc.edu/cytochromep450.html)后，被命名为cyp68j6。该p450酶在大肠杆菌、酵母菌比如酿酒酵母和毕赤酵母中能够进行异源表达，构建的其重组工程菌株能够高效催化dhea反应生成7α,15α-dioh-dhea。基于上述发现和研究，本发明提供了如下技术方案。
2、一种分离的多肽，其为p450酶，所述的多肽选自下组：
3、(a)具有seq id no.1氨基酸序列的多肽；
4、(b)将seq id no.1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；
5、(c)与(a)限定的多肽序列有80％以上同源性、82％以上同源性、85％以上同源性、88％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、优选98％以上同源性、更优选99％以上同源性，且具有(a)多肽功能及功能提高的由(a)衍生的多肽；或
6、(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。
7、上述多肽的功能是指催化去氢表雄酮(脱氢表雄酮，dhea，cas：53-43-0)进行c7位和c15位羟化反应生成7α,15α-双羟基去氢表雄酮(7α,15α-dioh-dhea)。
8、优选上述多肽的氨基酸序列为seq id no.1，是一种细胞色素p450酶，本文中命名为cyp68j6。
9、本发明的第二个方面提供了上述多肽用于制备甾体药物比如7α,15α-dioh-dhea或者黄体酮羟基化衍生物的用途。
10、本发明的第三个方面提供了分离的多核苷酸，其编码上述p450酶，所述的多核苷酸选自：
11、(a)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；
12、(b)编码如seq id no.1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
13、(c)核苷酸序列如seq id no.2所示的多核苷酸；
14、(d)核苷酸序列与seq id no.2所示核苷酸序列的同源性≥80％、同源性≥82％、同源性≥88％、同源性≥90％、同源性≥95％、优选≥98％、更优选≥99％的多核苷酸；
15、(e)与(a)-(d)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
16、优选上述多核苷酸的核苷酸序列为seq id no.2。
17、本发明的第四个方面提供了表达上述多肽比如cyp68j6的质粒，所述质粒上克隆有一个或两个以上拷贝的上述多核苷酸比如seq id no.2。当所述质粒在大肠杆菌比如大肠杆菌bl21(de3)中表达时，质粒载体可以是pet载体例如pet22b、pet24a、pet24b、pet28a、pet28b等，也可以是psh质粒等其他常用载体，但并不受限于此。当所述质粒在酵母菌比如酿酒酵母或毕赤酵母中表达时，质粒载体可以是pyes2、ppicz等，但不限于此。其中pyes2是一种可以在大肠杆菌和酿酒酵母中复制与扩增的穿梭载体。
18、本发明的第五个方面提供了异源表达上述多肽比如cyp68j6的微生物。上述微生物宿主的基因组中整合了上述的多核苷酸比如seq id no.2；或者是微生物宿主中转化了上述质粒的转化子。
19、上述微生物宿主可以是大肠杆菌比如大肠杆菌bl21(de3)，也可以是酵母菌比如酿酒酵母或毕赤酵母，但并不受限于此。
20、优选地，所述微生物宿主是酿酒酵母或者毕赤酵母，即异源表达上述多肽比如cyp68j6的微生物是重组的酿酒酵母工程菌或者毕赤酵母工程菌。
21、上述质粒的转化可以通过常规的化学转化法或者电转化方法转入细胞感受态中。
22、在一种实施方式中，上述基因组中整合可通过基因编辑技术实施，所述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent(multiplex genome editing by naturaltransformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
23、本发明的第六个方面提供了一种制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮的方法，其包括下述步骤：以dhea(脱氢表雄酮，cas：53-43-0)为底物，在上述多肽比如cyp68j6的催化下、或者氨基酸序列为seq id no.3的p450酶(本文中命名为cyp68j5_fg)的催化下、或者表达上述多肽比如cyp68j6的微生物的催化下、或者表达氨基酸序列为seq id no.3的p450酶cyp68j5_fg的微生物的催化下，通过进行c7位和c15位羟化反应来制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮(7α,15α-dioh-dhea)。
24、
25、优选地，上述方法中所述微生物是表达上述多肽比如cyp68j6的微生物或者表达氨基酸序列为seq id no.3的p450酶cyp68j5_fg的微生物是重组的酿酒酵母工程菌或者毕赤酵母工程菌。
26、本发明新发现的p450酶cyp68j6具有较高的羟化酶活性，表达cyp68j6的酿酒酵母重组菌和毕赤酵母重组菌都能高效催化dhea通过c7位和c15位羟基化制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮；本发明还意外发现另一种p450酶cyp68j5_fg具有相同的催化功能，丰富了对真菌细胞色素p450酶的研究，也为7α,15α-dioh-dhea的工业化生产奠定了理论基础。
1.一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述功能是指催化去氢表雄酮进行c7位和c15位羟化反应生成7α,15α-双羟基去氢表雄酮。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列为seq id no.1。
4.如权利要求1所述的多肽用于制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮的用途。
5.分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，核苷酸序列为seq id no.2。
7.表达如权利要求1-3中任一项所述多肽的质粒，其特征在于，质粒载体上克隆有一个或两个以上拷贝的如权利要求5或6中所述的多核苷酸。
8.表达如权利要求1-3中任一项所述多肽的微生物，其特征在于，在微生物宿主的基因组中整合了如权利要求5或6中所述的多核苷酸；或者是微生物宿主中转化了如权利要求7所述质粒的转化子。
9.一种制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮的方法，包括下述步骤：以去氢表雄酮为底物，在如权利要求1所述的多肽、或者氨基酸序列为seq id no.3的p450酶、或者表达它们的微生物催化下，通过进行c7位和c15位羟化反应来制备7α,15α-双羟基去氢表雄酮。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微生物是酿酒酵母或者毕赤酵母。
