本发明涉及生物。具体地，本发明涉及一种用于眼部基因递送的重组腺相关病毒载体。通过眼内施用所述重组腺相关病毒载体，在小梁网细胞中能够实现目的蛋白的增加且特异性的表达，由此缓解或治疗青光眼并且不会引起角膜水肿等副作用。
背景技术：
1、青光眼(glaucoma)是一种以病理性高眼压、视神经乳头萎缩、视野缺损、视力下降为特征的眼病，为全球首位不可逆的致盲性眼病。据世界卫生组织(who)统计，2020年全球约有7600万青光眼患者，且预计在2040年突破至1亿1千万人。庞大的患病基数给社会带来了极大的经济和社会负担。
2、青光眼可以大致划分为两个主要类别，为开角型青光眼和闭角型。提到青光眼时，“角”指虹膜和角膜之间的间隙，流体(眼房水)必须经所述间隙流动以经小梁网(trabecular meshwork)从眼流出，因此，调节小梁网收缩性可以治疗青光眼患者中升高的眼内压。
3、外酶c3转移酶(exoenzyme c3 transferase，c3)是从肉毒梭状芽孢杆菌(clostridium botulinum)中分离出来的一种蛋白质，其能够特异性作用于肌动蛋白细胞骨架和肌球蛋白稳定性的重要调节蛋白rho gtp酶(guanosine triphosphatases,rhogtpases，rho)，通过修饰rho，使rho核糖基化而失去功能，从而增加房水的排出，由此降低眼内压。
4、在通用型启动子(例如，cam启动子、cmv启动子等)调控下，携带c3基因的重组aav2可以感染小梁网细胞，有效地降解小梁网细胞内肌动蛋白结构，改变小梁网细胞形态。但由于通用型启动子不具有组织特异性，体内转导会感染角膜内皮细胞，并使得c3蛋白过表达，引起角膜水肿的副作用。
5、如果角膜水肿的副作用出现，患者必须愿意忍受它们，或与治疗医师沟通以改善药物治疗方案。对药物的依从性不良是青光眼患者中视力减退的一个主要原因。
6、在小梁网特异性启动子(例如，几丁质酶3样蛋白1(ch3l1)启动子、基质gla蛋白(mgp)启动子)调控下，携带c3基因的重组aav2能够特异性感染小梁网细胞并表达产生c3，避免了角膜水肿的副作用产生，但来自体内和体外的实验结果均表明，c3的表达较弱。用所述重组aav2体外感染小梁网细胞后，对小梁网细胞的形态改变不明显，前房给药后降眼压的效果也不够理想。
7、因此，本领域仍需要一种既能特异性感染小梁网细胞，又能提高目的基因表达量的用于眼部基因递送的重组腺相关病毒载体。
技术实现思路
1、本发明提供了一种携带目的基因表达框的aav病毒载体，所述aav病毒载体既能特异性感染小梁网细胞，又能提高目的基因表达量，且不作用于非靶组织，避免了副作用的出现。
2、因此，在第一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含seq id no：1所示的增强子序列或者与其具有至少约90％同一性的增强子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增强子序列，其能够用于增强目的基因的转录，并最终提高目的基因的表达量。
3、进一步地，本发明还提供了这样的分离的核酸分子，其能够用于增强目的基因在小梁网细胞中的转录，并最终提高目的基因在小梁网细胞中的表达量，包含有效连接的：
4、a.seq id no：1所示的增强子序列或者与其具有至少约90％同一性的增强子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增强子序列，以及
5、b.在小梁网细胞中高效表达的启动子序列，例如，seq id no：3所示mgp基因的启动子序列或seq id no：7所示人几丁质酶3样蛋白1基因的的启动子序列，或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的启动子序列。
6、在第二方面，本发明提供了一种外酶c3转移酶基因表达框，其包含有效连接的：
7、a.seq id no：1所示的增强子序列或者与其具有至少约90％同一性的增强子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增强子序列；
8、b.在小梁网细胞中高效表达的启动子序列，例如，seq id no：3或seq id no：7所示的启动子序列，或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的启动子序列；以及
9、c.编码外酶c3转移酶的核苷酸序列，例如，编码seq id no：4所示的或与seq idno：4具有至少约90％同一性(例如，约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的外酶c3转移酶的核苷酸序列。
10、在第三方面，本发明提供了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含第一方面所述的分离的核酸分子或第二方面所述的外酶c3转移酶基因表达框。
11、在第四方面，本发明提供了一种腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含第一方面所述的分离的核酸分子、第二方面所述的外酶c3转移酶基因表达框或第三方面所述的核酸表达载体。
12、在一些实施方案中，本发明的腺相关病毒载体是重组腺相关病毒(raav)载体，例如，重组aav1、aav2、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aavrh.10、aav11或aav12载体，优选地，重组aav2载体。
13、在一些实施方案中，本发明的腺相关病毒载体具有的基因组可自我互补形成双链dna分子。
14、在第五方面，本发明提供了一种药物，其包含第一方面所述的分离的核酸分子、第二方面所述的外酶c3转移酶基因表达框、第三方面所述的核酸表达载体、或者第四方面所述的腺相关病毒载体。
15、在第六方面，本发明提供了根据第一方面所述的分离的核酸分子、第二方面所述的外酶c3转移酶基因表达框、第三方面所述的核酸表达载体、第四方面所述的腺相关病毒载体、或者第五方面所述的药物的用途，用于缓解或治疗青光眼。
16、在一些实施方案中，所述青光眼是原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼。
17、在一些实施方案中，通过前房注射施用本发明的核酸表达载体或者腺相关病毒载体。
18、本发明的核酸表达载体或者本发明的腺相关病毒载体在体外研究中的结果表明，转导小梁网细胞后目的蛋白的表达量提高，小梁网细胞形态改变更明显；在体内研究中的结果表明，眼部基因递送(例如，前房注射)本发明的核酸表达载体或者腺相关病毒载体后，眼压降低的效果更显著，且能特异地转导小梁网细胞，而不会引起角膜水肿等副作用，为青光眼基因治疗提供了有前景的治疗方案。
1.分离的核酸分子，包含有效连接的：
2.外酶c3转移酶基因表达框，其包含有效连接的：
3.一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含权利要求1所述的分离的核酸分子或权利要求2所述的外酶c3转移酶基因表达框。
4.一种腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含权利要求1所述的分离的核酸分子、权利要求2所述的外酶c3转移酶基因表达框或权利要求3所述的核酸表达载体。
5.根据权利要求4所述的腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体是重组腺相关病毒(raav)载体，例如，重组aav1、aav2、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aavrh.10、aav11或aav12载体，优选地，重组aav2载体。
6.根据权利要求5所述的腺相关病毒载体，其基因组可自我互补形成双链dna分子。
7.一种药物，其包含权利要求1所述的分离的核酸分子、权利要求2所述的外酶c3转移酶基因表达框、权利要求3所述的核酸表达载体、或者权利要求4-6中任一项所述的腺相关病毒载体。
8.根据权利要求1所述的分离的核酸分子、权利要求2所述的外酶c3转移酶基因表达框、权利要求3所述的核酸表达载体、权利要求4-6中任一项所述的腺相关病毒载体、或者权利要求7所述的药物的用途，用于制备缓解或治疗青光眼的药物组合物，例如，所述青光眼是原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼，优选地，通过眼部基因递送(例如，前房注射)施用所述药物组合物。
9.分离的核酸分子，其包含seq id no：1所示的增强子序列或者与其具有至少约90％同一性的增强子序列，例如，与其具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增强子序列。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子的用途，用于增强目的基因的转录。
