本发明涉及生物，进一步涉及nk细胞体外扩增领域，特别涉及用于nk细胞扩增的添加剂组合物、扩增培养基、试剂盒及应用。
背景技术：
1、nk细胞，即自然杀伤细胞，是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的生物学功能，位于抵抗肿瘤和病毒的第一道防线。nk细胞主要分布于外周血中。nk细胞发挥杀伤作用的主要途径包括：(1)释放穿孔素和颗粒酶并激活caspase通路诱导靶细胞凋亡；(2)死亡受体(fasl,trail,tnf-α等)诱导凋亡；(3)分泌细胞因子；(4)抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,adcc)作用。
2、目前，nk细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，因此需要扩增nk细胞。目前，市面上大部分利用滋养层细胞来扩增nk细胞，而滋养层细胞大多是一些永生化的细胞，尽管经过辐射灭活，但是并不能确保充分灭活，容易带来致瘤性风险，对临床应用提出了较大的挑战。
3、因此，在nk细胞体外扩增领域中，亟需开发能够扩增出数量大且高活性的nk细胞的方法。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的包括提供一种用于nk细胞扩增的添加剂组合物，其包含特定含量比例的a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺，能够显著提高nk细胞的扩增效率。还提供了包含该添加剂组合物的扩增培养基，可用于配制前述添加剂组合物或扩增培养基的试剂盒，前述添加剂组合物、扩增培养基及试剂盒的应用，还提供了扩增nk细胞的方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种用于nk细胞扩增的添加剂组合物，其包括含量比例为(0.001～0.1ke):(0.5～50μmol):(0.5～50μmol)的a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺。
3、在一些实施方式中，a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺的含量比例为(0.005～0.05ke):(1～10μmol):(1～10μmol)。
4、在一些实施方式中，a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺的含量比例为(0.005～0.015ke):(4～6μmol):(4～6μmol)。
5、在一些实施方式中，唑来磷酸相对于来那度胺的摩尔比为0.1～10；可选地，唑来磷酸相对于来那度胺的摩尔比为0.9～1.1。
6、在本发明的第二方面，提供了一种nk细胞的扩增培养基，其包括基础培养基和本发明第一方面所述用于nk细胞培养的添加剂组合物；在所述扩增培养基中，所述添加剂组合物各组分的浓度分别为0.001～0.1ke/l的a群链球菌，0.5～50μmol/l的唑来磷酸以及0.5～50μmol/l的来那度胺。
7、在一些实施方式中，所述基础培养基为aim-v培养基。
8、在一些实施方式中，所述扩增培养基含有0.005～0.05ke/l的a群链球菌，1～10μmol/l的唑来磷酸以及1～10μmol/l的来那度胺。
9、在一些实施方式中，所述扩增培养基含有0.005～0.015ke/l的a群链球菌，4～6μmol/l的唑来磷酸以及4～6μmol/l的来那度胺。
10、在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，其包括：
11、(k1)基础培养基；
12、(k2)本发明第一方面所述用于nk细胞培养的添加剂组合物的各组分，按照含量比例包装于容器中；和
13、(k3)说明书或标签。
14、在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述用于nk细胞培养的添加剂组合物，或本发明第二方面所述nk细胞的扩增培养基，或本发明第三方面所述试剂盒在nk细胞扩增培养中的应用。
15、在本发明的第五方面，提供了一种扩增nk细胞的方法，其包括如下步骤：
16、制备含有外周血单个核细胞、基础培养基、人ab血清、人il-2以及本发明第一方面所述添加剂组合物的培养体系；其中，所述添加剂组合物的组分浓度满足：0.001～0.1ke/l的a群链球菌，0.5～50μmol/l的唑来磷酸以及0.5～50μmol/l的来那度胺；外周血单个核细胞的密度为1.5×106～4.5×106个/20ml，人ab血清的浓度为5％～20％(v/v)，人il-2的浓度为100～3000u/ml；
17、孵育所述培养体系。
18、在一些实施方式中，所述孵育所述培养体系的步骤满足如下特征中的一项或多项：
19、于37℃和5％ co2条件下孵育所述培养体系；
20、每隔预设时间补加所述基础培养基、人ab血清、人il-2、a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺中的一种或多种至相应组分的合适浓度；随所述培养体系体积的增加，将所述培养体系转移至更大容积的培养容器中继续孵育，转移次数为1次或多次；
21、将所述培养体系在t75培养瓶中进行初始孵育，以及将所述培养体系先后转移至t175培养瓶和1.8l透气培养袋中继续孵育；
22、达到预设孵育时间或所述培养体系达到预设细胞量时结束孵育。
23、在一些实施方式中，制备所述培养体系的步骤包括预先配制细胞悬液，将所述细胞悬液与所述培养体系的其余组分混合；其中，所述细胞悬液含有2.7×106～2.8×106个/20ml的外周血单个核细胞。
24、本申请的发明人通过大量的实验探索研究，意外地发现，当采用包含a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺的特定组合进行nk细胞扩增时，能够显著提高nk细胞的体外扩增效率。
25、利用本发明提供的添加剂组合物和扩增培养基进行体外扩增nk细胞，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的nk细胞。此外，扩增所得目标nk细胞的纯度高。
26、本发明提供的nk细胞的扩增方法，方法简单，nk细胞扩增效率高，所使用的培养体系采用细胞因子代替细胞添加物，能降低或避免加入外来细胞导致的致瘤性风险，进而为nk细胞在临床上的应用提供强有力的支持。
1.一种用于nk细胞扩增的添加剂组合物，其特征在于，所述添加剂组合物包括含量比例为(0.001～0.1ke):(0.5～50μmol):(0.5～50μmol)的a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺。
2.根据权利要求1所述的添加剂组合物，其特征在于，a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺的含量比例为(0.005～0.05ke):(1～10μmol):(1～10μmol)。
3.根据权利要求2所述的添加剂组合物，其特征在于，a群链球菌、唑来磷酸和来那度胺的含量比例为(0.005～0.015ke):(4～6μmol):(4～6μmol)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的添加剂组合物，其特征在于，唑来磷酸相对于来那度胺的摩尔比为0.1～10；
5.一种nk细胞的扩增培养基，其特征在于，包括基础培养基和权利要求1所述用于nk细胞培养的添加剂组合物；在所述扩增培养基中，所述添加剂组合物各组分的浓度分别为0.001～0.1ke/l的a群链球菌，0.5～50μmol/l的唑来磷酸以及0.5～50μmol/l的来那度胺。
6.根据权利要求5所述的扩增培养基，其特征在于，所述基础培养基为aim-v培养基。
7.根据权利要求5或6所述的扩增培养基，其特征在于，其中，所述扩增培养基含有0.005～0.05ke/l的a群链球菌，1～10μmol/l的唑来磷酸以及1～10μmol/l的来那度胺。
8.根据权利要求7所述的扩增培养基，其特征在于，所述扩增培养基含有0.005～0.015ke/l的a群链球菌，4～6μmol/l的唑来磷酸以及4～6μmol/l的来那度胺。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括：
10.权利要求1～4中任一项所述用于nk细胞培养的添加剂组合物，或权利要求5～8中任一项所述nk细胞的扩增培养基，或权利要求9所述试剂盒在nk细胞扩增培养中的应用。
11.一种扩增nk细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述孵育所述培养体系的步骤满足如下特征中的一项或多项：
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，制备所述培养体系的步骤包括预先配制细胞悬液，将所述细胞悬液与所述培养体系的其余组分混合；其中，所述细胞悬液含有2.7×106～2.8×106个/20ml的外周血单个核细胞。
