本发明涉及细胞培养领域，具体地涉及一种拟胚体消化液及其在分离造血干细胞中的应用。
背景技术：
1、造血干细胞作为成体干细胞的一种，位于造血系统级联的顶端，被认为是体内各种免疫细胞的“祖先”，具备极强的自我更新能力和多向分化潜力。人体内的造血干细胞最初来源于发育中的胚胎，从此一直持续人的一生，造血干细胞为机体源源不断的提供血液细胞。造血干细胞在临床上最早的应用就是造血干细胞移植，用于治疗白血病、再生障碍性贫血等血液系统疾病。近些年来随着生物医疗技术的不断发展，对造血干细胞研究的不断深入，使得造血干细胞及其衍生细胞在器官移植、基因遗传病的治疗、免疫系统疾病的治疗以及肿瘤治疗等等中都有了重大的进展和突破。然而，造血干细胞数量不足以及需hla配型的问题，一直是其临床应用的难点。
2、2006年，日本京都大学山中伸弥团队体外成功诱导得到诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，ipscs），并证实其可以体外分化为多种类型的细胞，从此打开了基础研究、药物研发以及个性化治疗的新篇章。ipsc体外无限扩增、多能干性以及便于基因编辑的优势使其成为潜力无限的各类细胞库的来源。因此，由ipsc体外诱导分化获得造血干细胞，有希望可以建立通用的且数量足够的造血干细胞库，进一步扩大造血干细胞及其衍生细胞的应用范围。
3、体外诱导ipsc向造血干细胞分化的方法多种多样，从分化形式而言，最初是基于2d的平面分化，通过添加各种相关的细胞因子，诱导平面培养的ipsc向造血干细胞的方向进行分化，然而2d分化的产量有限，且工业化生产存在难度。随着研究的进一步进行，人们发现ipsc在一定条件下悬浮培养，可自发形成称为拟胚体（embryoid bodies，eb）的聚合物，拟胚体有着类似于胚胎的胚层结构，可在外源细胞因子的作用下，向特性的细胞进行定向分化，这种基于拟胚体的分化，被认为更接近于体内分化，且3d的分化体系更利于工业化生产的要求。
4、从分化特定阶段的拟胚体中获取所需的造血干细胞，目前多采用市售的通用型消化酶，这些消化酶的开发是基于贴壁细胞传代的应用，因此在拟胚体这种组织水平的消化上，存在消化时间长，消化效率低等问题。因此，如何更好的从适合工业化生产的拟胚体分化体系中，最大效率的获取单细胞，进一步分析富集获得造血干细胞，无论对于造血干细胞本身或其衍生细胞领域的研发及临床应用，都是极为迫切的。
5、因此，本领域迫切需要开发从拟胚体中高效快速地分离得到单细胞的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的就是提供从拟胚体中高效快速地分离得到单细胞的方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种拟胚体消化液，所述拟胚体消化液由以下组分组成：
3、（i）胶原酶，其浓度为0.2-3.0 mg/ml；
4、（ii）分散酶，其浓度为0.15-2.5 mg/ml；
5、（iii）溶剂，所述溶剂为培养基或缓冲液。
6、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶。
7、在另一优选例中，所述i型胶原酶来源于溶组织梭菌。
8、在另一优选例中，所述分散酶为分散酶ii。
9、在另一优选例中，所述分散酶ii来源于多粘芽孢杆菌。
10、在另一优选例中，所述胶原酶的浓度优选地为0.4-2.0 mg/ml，更优选地为0.4-1.6 mg/ml，最优选地为0.8-1.6 mg/ml。
11、在另一优选例中，所述分散酶的浓度优选地为0.25-2.0 mg/ml，更优选地为0.3-1.5 mg/ml，最优选地为0.5-1 mg/ml。
12、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶，其浓度为0.8-1.6 mg/ml；并且，所述分散酶为分散酶ii，其浓度为0.5-1 mg/ml。
13、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶，其浓度为0.8 mg/ml；并且，所述分散酶为分散酶ii，其浓度为0.5 mg/ml。
14、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶，其浓度为1.6 mg/ml；并且，所述分散酶为分散酶ii，其浓度为1 mg/ml。
15、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶，其浓度为0.4 mg/ml；并且，所述分散酶为分散酶ii，其浓度为0.25 mg/ml。
16、在另一优选例中，所述培养基为细胞通用培养基、干细胞专用培养基、或拟胚体专用培养基。
17、在另一优选例中，所述培养基选自下组：dmem、modifiednutristem®hpsc xfmedium、nutristem®hpsc xf medium、stemspantmaof medium或stemdifftmapeltm2 medium。
18、在另一优选例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
19、在另一优选例中，所述缓冲液为dpbs。
20、在另一优选例中，所述消化液用于将拟胚体解离得到单细胞。
21、在本发明的第二方面，提供了一种消化拟胚体获得单细胞的方法，包括步骤：
22、使用本发明第一方面所述的消化液对拟胚体进行消化处理，得到消化后的细胞悬液。
23、在另一优选例中，所述拟胚体由多能干细胞培养形成。
24、在另一优选例中，所述多能干细胞包括：胚胎干细胞、诱导多能干细胞（ipsc）。
25、在另一优选例中，所述拟胚体为各分化阶段的拟胚体，包括造血干细胞分化阶段、造血谱系分化阶段、淋巴细胞分化阶段和/或nk细胞分化阶段。
26、在另一优选例中，所述消化处理的时间为1-4小时，优选地1.5-3小时，更优选地2-2.5小时。
27、在另一优选例中，所述消化处理过程中，每隔20-30分钟对消化体系进行吹打混匀。
28、在另一优选例中，所述消化处理的温度为37±5℃。
29、在另一优选例中，所述消化后的细胞悬液具有一种或多种选自下组的特征：
30、（y1）未解离的拟胚体占拟胚体总量的≤10%，优选地≤5%，更优选地≤1%；
31、（y2）单细胞的活率≥60%，优选地≥65%，更优选地≥70%；
32、（y3）单细胞的细胞类型丰富。
33、在另一优选例中，所述未解离的拟胚体指直径大于100 μm的细胞团块。
34、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述消化后的细胞悬液进行分选，获得目标种类的单细胞。
35、在另一优选例中，所述目标种类的单细胞为造血干细胞。
36、在另一优选例中，对所述消化后的细胞悬液进行cd34分选富集，获得cd34+的造血干细胞。
37、在另一优选例中，富集后cd34+造血干细胞的纯度≥85%，优选地≥90%，更优选地≥95%。
38、在另一优选例中，所述造血干细胞具有向多种细胞分化的潜能，包括：nk细胞、t细胞、巨核细胞、或其组合。
39、在本发明的第三方面，提供了一种活性成分组合的用途，用于制备一试剂，所述试剂用于消化或解离拟胚体；
40、所述活性成分组合由（i）第一活性成分：胶原酶，和（ii）第二活性成分：分散酶组成。
41、在另一优选例中，所述胶原酶为i型胶原酶，所述i型胶原酶来源于溶组织梭菌。
42、在另一优选例中，所述分散酶为分散酶ii，所述分散酶ii来源于多粘芽孢杆菌。
43、在另一优选例中，所述试剂中胶原酶的浓度为0.2-3.0 mg/ml，优选地为0.4-2.0mg/ml，更优选地为0.4-1.6 mg/ml，最优选地为0.8-1.6 mg/ml。
44、在另一优选例中，所述试剂中分散酶的浓度为0.15-2.5 mg/ml，优选地为0.25-2.0 mg/ml，更优选地为0.3-1.5 mg/ml，最优选地为0.5-1 mg/ml。
45、在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
46、(c1) 第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的拟胚体消化液；以及
47、说明书或标签，所述说明书或标签注明所述试剂盒用于消化拟胚体获得单细胞。
48、在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
49、(c2) 第二容器，所述第二容器中含有细胞分选试剂，用于对拟胚体消化后的细胞悬液进行分选，获得目标种类的单细胞。
50、在另一优选例中，所述目标种类的单细胞为造血干细胞。
51、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
52、本发明的有益效果包括：
53、1. 本发明的消化液能够快速高效解离拟胚体从而获得高活率单细胞悬液,得到可用于后续分化或研究的消化液。
54、2. 本发明的消化液中两种酶可以起到协同作用，使得消化所得的单细胞可以保持较高的细胞活率、良好的细胞表型以及细胞类群的多样性。
55、3. 用本发明的方法解离得到的单细胞可以进一步分选得到目标细胞，例如造血干细胞。
56、4. 用本发明的方法解离并分选得到的造血干细胞拥有向多种免疫细胞分化的潜力，可分化获得各种不同类型的目的细胞，且分化效率好、分化产量高，有利于进一步的科研及临床应用。
1.一种拟胚体消化液，其特征在于，所述拟胚体消化液由以下组分组成：
2.如权利要求1所述的拟胚体消化液，其特征在于，所述胶原酶为i型胶原酶。
3.如权利要求1所述的拟胚体消化液，其特征在于，所述分散酶为分散酶ii。
4.一种消化拟胚体获得单细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化处理的时间为1-4小时。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：对所述消化后的细胞悬液进行分选，获得目标种类的单细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标种类的单细胞为造血干细胞。
8.一种活性成分组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂，所述试剂用于消化或解离拟胚体；
9. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
