本发明涉及用于降低编码fus rna结合蛋白(也称为肉瘤融合蛋白(fused insarcoma))的fus基因的表达的反义寡核苷酸(aon)。本发明提供了通过施用aon选择性地降低fus转录本的特定等位基因表达的方法，以便降低包含与神经退行性疾病相关的致病性变异的fus的表达。
背景技术：
1、以下对背景技术的讨论仅旨在促进对本发明的理解。该讨论并非承认或认可所提及的任何材料在本技术的优先权日时是或曾经是公知常识的一部分。
2、fus
3、fus编码一种普遍表达的526个氨基酸的蛋白质，属于rna结合蛋白的fet家族。fus在正常生理条件下主要定位于细胞核，但会跨越至细胞质，在核质运输中起作用。fus在多种细胞过程中发挥作用，包括转录、前体mrna剪接、rna运输和翻译调节。fus还参与dna修复机制，包括dna双链断裂修复期间的同源重组和非同源末端连接。另外，fus在旁斑(paraspeckle)的形成中发挥作用，提供针对多种类型应激的细胞防御。
4、多达10％的肌萎缩侧索硬化症(als)患病个体具有至少一名其他患病家庭成员，并被定义为患有家族性als(fals)；已经发现几乎所有这些病例都以常染色体显性方式遗传。其余90-95％的als病例发生在没有家族病史的人群中；这些个体被认为患有散发性als(sals)。fus中的致病性变异是造成大约5％的fals病例和少于1％的sals病例的原因。
5、目前已在als患者中鉴定了超过50种常染色体显性fus变体。大多数是错义突变，但在极少数的情况下，插入、缺失、剪接和无义突变也有报道。许多致病性变体聚集在核定位信号内，并导致fus重新分布到细胞质中。其他发生于富甘氨酸和精氨酸区域、朊病毒样结构域和3′utr中。某些区域内的变体似乎增加了蛋白质形成固体聚集体的倾向，这指向了在fus相关als中起作用的多种病理机制。
6、fus是自动调节的(autoregulated)，其中一种机制涉及蛋白与其自身前体mrna结合以抑制外显子7的表达。外显子7跳跃剪接变体中的移码会导致一个提前终止密码子，从而转录本遭受无义介导的衰变。在fus-als(fus-肌萎缩性侧索硬化)和fus-ftd(fus-额颞叶痴呆)中，fus在细胞质中的错误定位可能损害自动调节，这可能导致过表达。
7、受损的细胞功能也可能是致病性fus变体的直接结果，据报道这些变体会引起剪接缺陷、dna损伤并损害fus的自动调节。另外，有迹象表明fus-als中存在疾病传播的机制，可能是由其朊病毒样蛋白结构域介导的。
8、关于fus-als中功能丧失或功能获得机制引起疾病的程度的争论仍在继续。fus功能丧失理论假设fus的病理性细胞质重新分布使其不能在细胞核中执行其功能。来自小鼠模型的证据表明fus的丢失不足以引起als。然而，当使用果蝇fus敲低模型时，研究结果是矛盾的，其中在fus直系同源物cabeza敲低后，出现了神经元变性和运动缺陷。
9、有强有力的证据表明，功能获得机制在fus-als中起作用。据报道，过表达野生型人fus的转基因小鼠模型出现了运动神经变性的侵袭性表型和细胞质fus积累的证据。关于毒性是否主要由fus聚集体直接介导，还是通过fus重新分布后细胞质中可溶性fus的增加介导，仍存在争论。细胞质fus分布也会改变应激颗粒动力学。fus的聚集倾向并非纯粹的病理性，而是对正常细胞功能很重要。有人提出fus聚集可能是一种补偿机制，保护细胞免受可溶性细胞质fus中潜在毒性增加的影响。
10、致病性fus变体与早发性和青少年als相关，其表现为持续进行性肌肉萎缩和无力，在大多数情况下，对呼吸肌的影响将疾病发作后的生存期限制在3年以内。目前的治疗方案是基于症状管理和呼吸支持，唯一批准的药物仅能延长几个月的生存期或仅在某些患者中提供适度的益处。目前缺乏减缓或暂停疾病进展的有效治疗。
11、由于fus聚集、过量表达或细胞质错误定位引起的毒性功能获得的有力的证据，fus的敲低通常被认为是治疗患有致病性fus突变的患者的可接受的治疗策略。几名患者在同情用药(compassionate use)的基础上接受了fus靶向aon的研究，该治疗(ion363)目前正在进行3期临床试验(nct04768972)。由于fus在多种dna修复机制中起关键作用，参与许多其他基因的调控和剪接，并在防御细胞应激中起作用，因此担心敲除fus会由于其不能发挥这些作用而在将来导致健康风险。因此，已经寻求一种策略，即选择性地将一个fus等位基因敲低超过另一个fus等位基因，所述另一个fus等位基因可以靶向患者致病性变异所在的等位基因。
12、等位基因选择性敲低策略
13、fus-als是一种显性疾病，绝大多数受影响的患者仅在其两个等位基因之一中携带有害的变体。这使得基于aon的等位基因特异性fus敲低方法成为治疗这些患者的可行策略。由于fus通过其蛋白水平自动调节，所以有可能利用aon选择性地敲低含有致病性变体的前体mrna和mrna的表达，同时留下足够的正常mrna以产生生理上健康量的蛋白质。
14、这种等位基因选择性策略使用基于gapmer的aon设计，其利用了内源性酶核糖核酸酶h(rnase h)。rnase h是一种非序列特异性的内切核酸酶，其催化dna/rna异源双链中rna链的裂解。gapmer由与rnase h活性相容的基于dna的核心组成，其侧接许多可被广泛修饰且不需要与rnase h活性相容的碱基(侧翼(wings))。gapmer可以直接靶向其中等位基因之间存在变异的rna区域，并利用该变异产生对靶等位基因的选择性。可以修饰gapmer的几种特性，这些特性可能会增加对靶等位基因的选择性，其效果通常需要通过实验确定。修饰可包括gapmer和靶rna之间错配的数目、位置和碱基组成、窗口(空位)或侧翼长以及分子长度和化学性质的变化。
15、fus-als相对罕见，并且已经报道了fus中至少50种常染色体显性als相关突变。由于存在大量的致病性变体，每种变体都非常罕见，这使得制药公司投入资源来开发对每种变体的等位基因特异性治疗在经济上是不可行的，为此，fus中的常见变体已经成为目标。
16、fus蛋白病
17、降低含有致病性变异的fus等位基因的表达可应用于预防和治疗与fus蛋白质病相关的疾病，包括fus-als和fus-ftld或患者可能具有致病fus突变的其他神经系统病症。含有致病性变异的fus等位基因的表达也可能应用于预防和治疗以下疾病：肌萎缩性侧索硬化(als)、额颞叶痴呆(ftd)和特发性震颤(et)。
18、正是在这种背景下开发了本发明。具体而言，本发明旨在提供一种改善与致病性fus遗传变体相关的疾病中的fus蛋白病的手段。
技术实现思路
1、本发明涉及靶向编码fus的核酸的化合物，特别是aon。本发明的实施方案涉及能够结合fus前体mrna或mrna的aon。
2、广义地，根据本发明的第一方面，提供了一种靶向编码fus前体mrna或mrna的核酸分子的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸具有如下核碱基序列：(a)选自由seq idno:1至seq id no:34或其变体组成的列表；或(b)与seq id no:1至seq id no:34也与之结合的靶fus前体mrna或mrna或其变体中的至少1个或多个连续核碱基互补，其中所述反义寡核苷酸抑制fus基因或其fus基因变体中的至少一个等位基因的表达，并且其中所述反义寡核苷酸基本上是分离的或纯化的。
3、在一个实施方案中，等位基因包含fus基因的致病性变体。在另一个实施方案中，致病性变体是增加个体对疾病的易感性或倾向性的遗传改变。
4、在另一个实施方案中，疾病选自：als、ftd、et。优选地，疾病选自：als或ftd。优选地，疾病选自：fus-als或fus-ftd。
5、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸结合fus上的外显子3、外显子4或3′utr中包含的转录本区域。优选地，反义寡核苷酸与包含cv(rs741810)、cv2(rs1052352)或cv3(rs4889537)的转录本的区域结合。
6、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸选择性敲低fus或其fus变体的前体mrna和/或mrna的一个等位基因的表达，同时留下足够的正常mrna以产生大量的蛋白质。
7、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸诱导rnase h介导的fus前体mrna和/或fusmrna的降解。
8、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(thiophosphoramidate morpholino oligomer)(tmo)嵌合体。
9、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(tmo)嵌合体，其具有包含tmo和硫代磷酸酯dna或dna亚基的gapmer设计。
10、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是肽-硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(tmo)嵌合体缀合物。
11、在另一个实施方案中，反义寡核苷酸选自由以下组成的列表：seq id no:1至12。优选地，反义寡核苷酸是seq id no:2、4、5、8或11。
12、根据本发明的另一方面，提供了一种诱导fus前体mrna和mrna的选定等位基因选择性敲低的方法，该方法包括步骤：(a)提供根据权利要求1至14中任一项所述的反义寡核苷酸中的一种或多种；和(b)使寡聚物与靶核酸位点结合。
13、根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的组合物，该组合物包含：(a)根据本发明第一方面的一种或多种反义寡核苷酸；和(b)一种或多种治疗上可接受的运送载体(carrier)和/或稀释剂。
14、根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的药物组合物，该组合物包含：(a)本发明第一方面的一种或多种反义寡核苷酸；和(b)一种或多种药学上可接受的运送载体和/或稀释剂。
15、根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗、预防或改善与fus基因致病性变体相关疾病影响的方法，该方法包括对个体施用有效量的本发明药物组合物的步骤。
16、在一个实施方案中，致病性变体是增加个体对疾病的易感性或倾向性的遗传改变。在另一个实施方案中，疾病选自：als、ftd或et。优选地，疾病选自：als或ftd。优选地，疾病选自：fus-als或fus-ftd。
17、根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防或改善通过生物标志物鉴定的患者中与fus基因致病性变体相关的疾病影响的方法，所述方法包括以下步骤：(a)测试个体中与fus蛋白病相关的疾病相关的生物标志物的存在，其中患者可能对fus抑制有反应；和(b)如果发现个体表达该生物标志物，则向个体施用有效量的本发明的药物组合物。优选地，疾病选自：als或ftd。优选地，所述生物标志物是fus基因的致病性变体。
18、根据本发明的另一个方面，提供了一种降低个体中选定的fus等位基因的表达和/或降低个体中由自动调节引起的fus的过表达的方法，该方法包括向个体施用有效量的本发明的药物组合物的步骤。
19、根据本发明的另一个方面，提供了一种方法：(a)降低个体中选定的fus等位基因的表达；和/或(b)降低个体中由自动调节引起的fus的过表达，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：根据本发明第一方面的一种或多种反义寡核苷酸；和一种或多种药学上可接受的运送载体和/或稀释剂。
20、根据本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含一种或多种根据本发明第一方面的反义寡核苷酸。
21、根据本发明的另一个方面，提供了一种细胞，其包含根据本发明第一方面的反义寡核苷酸。
22、根据本发明的另一方面，提供了根据本发明第一方面的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关疾病影响的药物中的用途。
23、根据本发明的另一方面，提供了根据本发明第一方面的反义寡核苷酸在用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关疾病影响中的用途。优选地，疾病选自：als或ftd。
24、根据本发明的另一方面，提供了用于治疗、预防或改善个体中与致病性fus变体相关的疾病影响的试剂盒，其中该试剂盒至少包含包装在合适容器中的根据本发明第一方面的反义寡核苷酸及其使用说明书。
25、本发明的其他特征在以下对其几个非限制性实施方案的描述中得到更全面地描述。包括该描述仅是为了举例说明本发明。不应将其理解为对如上所述的本发明的广泛概述、公开或描述的限制。
1.一种靶向编码fus前体mrna或mrna的核酸分子的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有如下核碱基序列：
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述等位基因包含fus基因的致病性变体。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述致病性变体是增加个体对疾病的易感性或倾向性的遗传改变。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述疾病选自：als、ftd、et。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述疾病选自：als或ftd。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病选自：fus-als或fus-ftd。
7.根据前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸结合fus上的外显子3、外显子4或3′utr内包含的转录本区域。
8.根据权利要求7所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与包含cv(rs741810)、cv2(rs1052352)或cv3(rs4889537)的转录本区域结合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸选择性地敲低fus或其fus变体的前体mrna和/或mrna的一个等位基因的表达，同时留下足够的正常mrna以产生大量的蛋白质。
10.根据上述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸诱导rnase h介导的fus前体mrna和/或fus mrna的降解。
11.根据前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(thiophosphoramidate morpholino oligomer)(tmo)嵌合体。
12.根据权利要求11所述的反义寡核苷酸，其中所述硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(tmo)嵌合体具有包含tmo和硫代磷酸酯dna或dna亚基的gapmer设计。
13.根据权利要求11或12所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是肽-硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(tmo)嵌合体缀合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸选自由seqid no:1至12组成的列表。
15.根据权利要求14所述的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是seq id no:2、4、5、8或11。
16.一种诱导fus前体mrna和mrna的选定等位基因的选择性敲低的方法，所述方法包括步骤：
17.一种用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的组合物，所述组合物包含：
18.一种用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的药物组合物，所述组合物包含：
19.一种用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如权利要求18所述的药物组合物的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述致病性变体是增加所述个体对所述疾病的易感性或倾向性的遗传改变。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病选自：als、ftd或et。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病选自：als或ftd。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自：fus-als或fus-ftd。
24.一种用于治疗、预防或改善通过生物标志物鉴定的患者中与fus基因致病性变体相关的疾病影响的方法，所述方法包括以下步骤：
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病选自：als或ftd。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物标志物是所述fus基因的致病性变体。
27.一种降低个体中选定的fus等位基因的表达和/或降低个体中由自动调节引起的fus的过表达的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求18所述的药物组合物的步骤。
28.一种方法：
29.一种表达载体，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的一种或多种反义寡核苷酸。
30.一种细胞，其包含权利要求1至15中任一项所述的反义寡核苷酸。
31.根据权利要求1-15中任一项所述的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响的药物的用途。
32.根据权利要求1-15中任一项所述的反义寡核苷酸在用于治疗、预防或改善与fus基因的致病性变体相关的疾病影响中的用途。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述疾病选自：als或ftd。
34.一种用于治疗、预防或改善个体中与致病性fus变体相关的疾病影响的试剂盒，其中
