本发明属于合成生物学，特别涉及一种固定化大肠杆菌生产高纯度s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法。
背景技术：
1、羟丙基四氢吡喃三醇，又名玻色因，是一种具有独特生理活性的木糖衍生物，具有抗皮肤衰老、促进胶原蛋白合成等作用，被广泛应用于化妆品领域。玻色因具有(r)-玻色因与(s)-玻色因两种构型，其中s构型生物活性最佳。在现有的相关技术资料中，(s)-玻色因的制备主要通过化学法或生物酶法还原β-d-吡喃木糖基丙酮实现。
2、化学法广泛采用多种化学试剂作为还原剂，如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰基硼氢化钠、氢化铝锂、二异丁基氢化铝以及红铝等，这些试剂均能有效促进β-d-吡喃木糖基丙酮的还原反应，从而生成玻色因。此外，部分文献报道了一种更为复杂的化学合成路径，该路径首先通过对酮中间体进行酰化保护，生成三酰基酮中间体，随后利用硼还原剂对三酰基酮中间体进行还原，并最终通过脱保护步骤获得玻色因。然而，这种使用含硼还原剂的化学法在合成(s)-玻色因时，面临着后处理过程中的一个显著难题：即需要复杂的工艺来彻底去除硼酸盐。这不仅显著增加了生产成本，还可能因硼酸盐去除不彻底而严重影响产品的最终质量。
3、另外，随着合成生物学的蓬勃发展，采用生物酶法合成(s)-玻色因因其安全高效、立体选择性专一等显著优势，正逐渐成为玻色因工业合成的热门研究方向。然而，人们在深入探索中发现，当前生物酶法合成玻色因面临着几项关键挑战。首先，羰基还原酶及脱氢酶在合成过程中常采用粗酶液或细胞破碎液作为催化剂，这不可避免地导致催化结束后体系中混入了大量菌体碎片、蛋白、氨基酸等杂质。这些杂质的存在极大地增加了后续提取与纯化的难度，不仅推高了生产成本，还使得高纯度玻色因成品的获取变得异常困难。其次，现行的生物酶法合成玻色因流程中，通常需要额外添加价格昂贵的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐（nadp）作为辅酶。这一需求无疑进一步加重了生产的经济负担，限制了玻色因在更广泛领域内的应用与推广。
4、因此，减少杂质生成，降低合成生产成本将是优化生物酶法合成(s)-玻色因的工艺的关键所在。
技术实现思路
1、本发明为解决以上技术问题，提出了一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法。
2、本发明提供的固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，包括以下步骤：
3、（1）将羰基还原酶和醇脱氢还原酶导入同一大肠杆菌，构建重组大肠杆菌工程菌；
4、（2）对（1）中重组大肠杆菌工程菌培养及固定化；
5、（3）加入底物β-d-吡喃木糖基丙酮，利用（2）中固定化后的完整的大肠杆菌细胞催化底物反应生成s构型羟丙基四氢吡喃三醇。
6、优选的，（1）中重组大肠杆菌工程菌兼备羰基还原酶及醇脱氢还原酶的同时，也含有还原辅酶nadp，只需要加入底物β-d-吡喃木糖基丙酮即可催化生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇。
7、优选的，（3）中固定化后的完整的大肠杆菌细胞在催化过程中无需进行破碎处理，催化后，通过80~100目筛网简单过滤操作后即可回收利用，循环使用次数≥10。
8、优选的，（2）中重组大肠杆菌工程菌的培养，包括以下的步骤：将（1）中的重组大肠杆菌工程菌接入含卡那霉素的lb液体培养基中，培养，加入iptg进行诱导；然后离心，收集菌体，将菌体用磷酸钾缓冲液重悬，获得包含羰基还原酶和醇脱氢酶的菌液。
9、优选的，（2）中重组工程菌的固定化过程包括通过吸附或包埋法进行细胞固定化，更优选的，通过加入交联剂，将细胞固定于载体上。
10、优选的，（2）中重组大肠杆菌工程菌的固定化，包括以下的步骤：
11、取（1）中重组大肠杆菌工程菌，培养，离心，得到菌体；
12、菌体用磷酸钾缓冲液重悬，获得包含羰基还原酶和醇脱氢酶的菌液，菌液与海藻酸钠溶液混合均匀，滴入到氯化钙溶液中，形成大小均一的固定化酶凝胶颗粒，冷藏静置硬化；然后用磷酸钾缓冲液和水洗涤凝胶颗粒，干燥后加入戊二醛水溶液，室温下搅拌交联，最后用磷酸钾缓冲液和水洗涤凝胶颗粒，得到固定化大肠杆菌细胞。
13、优选的，（2）中，磷酸钾缓冲液的浓度为100 mm、ph 7.0；海藻酸钠溶液浓度为25g/l；菌液与海藻酸钠溶液的质量比为2：1；
14、滴入氯化钙溶液时采用蠕动泵将混合液以300 ml/h的速度滴入；氯化钙溶液的浓度为30 g/l；
15、10℃冷藏静置硬化的时间为2 h；戊二醛水溶液的浓度为0.05 wt%；
16、搅拌交联的时间为4h，转速为100 rpm；
17、每次洗涤的次数为3次。
18、优选的，（3）中，催化过程包括以下的步骤：
19、在磷酸钾缓冲液中，加入底物β-d-吡喃木糖基丙酮、辅料和固定化大肠杆菌细胞，于35℃、400 rpm搅拌下反应12 h，得到催化液；
20、其中，辅料选自甲醇、乙醇或异丙醇中的任一种；
21、磷酸钾缓冲液的浓度为100 mm、ph 7.0；
22、磷酸钾缓冲液、β-d-吡喃木糖基丙酮、异丙醇、固定化大肠杆菌细胞湿重的质量比为：450~550：200~250：50~85：12~25，更优选的，磷酸钾缓冲液、β-d-吡喃木糖基丙酮、异丙醇、固定化大肠杆菌细胞湿重的质量比为：500：216：83：18。
23、优选的，（3）中添加的固定化大肠杆菌细胞湿重：β-d-吡喃木糖基丙酮（w:w）= 1~10:50；更优选的，添加固定化后的重组工程菌：β-d-吡喃木糖基丙酮（w:w）= 3~5:50。
24、优选的，（3）中催化获得的催化液经过滤后用电渗析或树脂进行脱盐，至电导率≤200 μs/cm；更优选的，催化液先经过强酸型阳离子交换树脂，再经过强碱性阴离子交换树脂，至催化液电导率降至≤50 μs/cm，获得脱盐液。
25、优选的，（3）中脱盐液在50-90℃下采用真空浓缩的方式进行浓缩，浓缩至以玻色因计≥70wt%，获得浓缩液；
26、优选的，（3）中浓缩液以每小时3℃的降温速率开始降温，直至温度达到5℃，离心或抽滤得到高纯度s构型玻色因晶体。
27、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
28、（1） 本发明将重组菌体进行固定化后用于玻色因的生产，固定化后两种酶仍表现出很高的活性，催化β-d-吡喃木糖基丙酮生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的反应具有转化率高、专一性强的特点，所获得的最终产品异构体纯度高，ee值≥99.9%，此外，在催化反应结束后大肠杆菌细胞保持完整，可回收循环使用10~15次，多次使用后两种酶于菌体内的活力仍可满足生产需求。
29、（2） 催化上清液成分简单明晰，含有的杂质基本上都是无机盐、丙酮及残余的少量异丙醇，通过树脂脱盐、浓缩、结晶，即可得到hplc纯度≥99.5%的s构型玻色因。
30、（3） 整体工艺非常适合大规模生产，具有很高的经济效益。
1.一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，（2）中，重组大肠杆菌工程菌的培养包括以下的步骤：将（1）中的重组大肠杆菌工程菌接入含卡那霉素的lb液体培养基中，培养，加入iptg进行诱导；然后离心，收集菌体，将菌体用磷酸钾缓冲液重悬，获得包含羰基还原酶和醇脱氢酶的菌液。
3.如权利要求2所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，（2）中，重组大肠杆菌工程菌的培养包括以下的步骤：将（1）中的重组大肠杆菌工程菌接入含卡那霉素50 μg/ml的lb液体培养基中，于37℃、150 rpm下培养至od600至2.0，加入终浓度为0.1 mm的iptg进行诱导，25℃诱导16 h；然后6000 rpm离心10 min，收集菌体，将菌体用浓度为100 mm、ph 7.0的磷酸钾缓冲液重悬，获得包含羰基还原酶和醇脱氢酶的菌液。
4.如权利要求1所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，（2）中，重组大肠杆菌工程菌的固定化包括以下的步骤：
5.如权利要求4所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，（2）中，磷酸钾缓冲液的浓度为100 mm、ph 7.0；海藻酸钠溶液浓度为25 g/l；菌液与海藻酸钠溶液的质量比为2：1；
6.如权利要求1所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，（3）中，催化过程包括以下的步骤：
7.如权利要求6所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，将催化过程所获得的催化液进行除盐，收集脱盐液，然后60℃水浴真空进行浓缩，得到浓缩液；
8.如权利要求7所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，将催化过程所获得的催化液用0.45 μm滤膜过滤后，用732阳离子交换树脂和三菱pa308阴离子交换树脂进行除盐，上样速度为2 bv/h，收集脱盐液，然后60℃水浴真空进行浓缩，得到浓缩液；
9.如权利要求1所述的一种固定化大肠杆菌生产s构型羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
