本发明涉及生物，更具体地说，它涉及一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法及应用。
背景技术：
1、外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级小囊泡。它们广泛分布在生物体血液、尿液、胸腹腔积液等几乎所有体液中。外泌体电镜下观察呈杯状或盘状。作为细胞间通讯和遗传物质的重要载体，外泌体可以通过各种生物活性分子，如细胞膜受体、蛋白质、信使rna（messengerrna，mrna）和微小rna（microrna，mirna）的转移直接刺激靶细胞，从而发挥其生物学功能。
2、生物活性因子调节代谢、免疫、细胞分化、增殖、迁移、营养、存活、凋亡和组织器官功能。外泌体常用的提取技术有差速离心，过滤离心，色谱法等，这些方法各有优缺点，但到目前为止，仍然没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度及生物活性。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法及应用。
2、一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，包括如下步骤：
3、s1：间充质干细胞的培养；
4、将从脐带组织分离得到的间充质干细胞接种到人脂肪组织支架上，采用无血清培养基进行培养；
5、s2：超临界流体提取外泌体；
6、将培养后的人脂肪组织支架转移到超临界流体提取装置中，引入超临界二氧化碳流体作为提取介质，收集含有外泌体的超临界流体，通过降压和气液分离，获得富含外泌体的悬浮液；
7、s3：微流控芯片纯化外泌体；
8、将含有外泌体的悬浮液导入集成化微流控芯片系统，集成化微流控芯片系统包括微流控芯片，微流控芯片内设有滤膜和亲和纯化单元，可实现外泌体的连续分离和纯化；
9、悬浮液首先通过滤膜，根据外泌体的尺寸差异，实现外泌体与其他杂质的初步分离，滤液再进入亲和纯化单元，该单元内固定有特异性识别外泌体表面标志物的抗体，外泌体与抗体特异性结合，杂质则被洗脱，实现外泌体的进一步纯化，收集纯化后的外泌体悬浮液；
10、s4：磁性纳米颗粒富集外泌体；
11、将纯化后的外泌体悬浮液与功能化磁性纳米颗粒混合，利用颗粒表面偶联的特异性抗体与外泌体表面标志物的亲和作用，实现外泌体的进一步富集；
12、在外加磁场的作用下，结合了外泌体的磁性纳米颗粒被分离，而游离的杂质则被去除；
13、洗脱并收集结合在磁性纳米颗粒上的外泌体，获得高纯度的外泌体制剂。
14、s5：外泌体的表征和储存；
15、对制备得到的外泌体进行形态学、粒径分布、蛋白质组成表征，将外泌体制剂分装后，在-80℃条件下长期保存，以维持其生物活性。
16、进一步地：在步骤s1中，人脂肪组织支架的制备过程为：
17、s11：获取新鲜的人脂肪组织，将获取的脂肪组织置于无菌的pbs缓冲液中，冰上保存并进行后续处理；
18、s12：脱细胞处理；
19、具体为：将人脂肪组织切碎，然后依次进行酶解处理、去垢处理、清洗处理；
20、s13：将清洗后的脱细胞脂肪组织置于-80℃冰箱中预冻2小时，然后转移至冷冻干燥机中真空抽干24-48小时，直至组织完全干燥；
21、s14：将冷冻干燥后的脱细胞脂肪组织支架置于γ射线或环氧乙烷中进行灭菌处理，灭菌后的人脂肪组织支架在干燥、避光条件下保存备用。
22、优选的：在步骤s12中，脱细胞处理的具体过程为：
23、切碎：使用无菌手术剪将脂肪组织切碎至2-3 mm的小块，以利于脱细胞试剂的渗透；
24、酶解处理：将切碎的脂肪组织置于含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的pbs缓冲液中，37℃水浴振荡消化4-6小时；
25、去垢处理：将酶解后的脂肪组织转移至含有1% triton x-100和1% 十二烷基硫酸钠（sds）的去垢剂溶液中，室温振荡12-24小时。
26、清洗：用无菌的pbs缓冲液反复清洗脱细胞脂肪组织3-5次，每次清洗30分钟，以去除残留的脱细胞试剂。
27、进一步地：在步骤s1中，首先取新鲜脐带组织，采用胶原酶消化法分离得到间充质干细胞；将细胞悬液以106个/ml的密度接种到人脂肪组织支架上，置于37℃、5% co2的细胞培养箱中培养，采用无血清、低葡萄糖dmem培养基，添加bfgf、egf等生长因子，每2-3天更换培养基，培养2-3周直至细胞铺满人脂肪组织支架。
28、进一步地：在步骤s2中，超临界流体提取装置包括高压泵、提取罐、分离罐、压力和温度控制系统。将步骤s1中培后的人脂肪组织支架置于在提取罐中，通过高压泵引入超临界二氧化碳流体；
29、提取条件控制：调节温度至35-45℃，压力7-20mpa，使二氧化碳达到超临界状态；
30、提取过程：超临界二氧化碳在提取罐中与人脂肪组织支架充分接触30-60min，溶解人脂肪组织支架上细胞的细胞膜并萃取外泌体，含外泌体的超临界流体进入分离罐，通过降压至亚临界状态，使外泌体从超临界流体中析出，收集分离罐底部富集的外泌体悬浮液，真空冷冻干燥或超滤浓缩，得到高纯度外泌体制剂。
31、进一步地：在步骤s3中，微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（pdms）材料，利用软光刻手段制成；
32、微流控芯片内依次集成进样口、滤膜单元、亲和纯化单元和出样口；
33、滤膜单元内置有聚碳酸酯膜，用于外泌体的初步分离；
34、亲和纯化单元内表面修饰有抗cd9、cd63抗体，可特异性捕获外泌体。
35、进一步地：在步骤s3中，纯化外泌体的流程为：取步骤s2中超临界流体提取的外泌体悬浮液，以20μl/min流速导入微流控芯片；
36、悬浮液首先通过滤膜，去除杂质，滤液进入亲和纯化单元；
37、外泌体表面的cd9、cd63与芯片内固定化抗体特异性结合，而残留杂质则随洗脱液流出芯片；
38、停止进样，用洗脱缓冲液以50μl/min流速洗脱捕获的外泌体，并用收集管收集洗脱的外泌体悬浮液。
39、进一步地：在步骤s4中，功能化磁性纳米颗粒的制备过程如下：
40、选择磁性fe3o4纳米颗粒，粒径约50-100nm；
41、在颗粒表面修饰特异性识别外泌体表面标志物的抗体；
42、将抗体与活化的磁性纳米颗粒混合，孵育数小时，使抗体牢固偶联到颗粒表面；
43、洗涤、分离并收集偶联了抗体的磁性纳米颗粒。
44、进一步地：在步骤s4中，将纯化后的外泌体悬浮液与功能化磁性纳米颗粒混合，孵育30分钟至3小时；
45、外泌体表面的特异性标志物与颗粒表面的抗体特异性结合，使外泌体被捕获到磁性纳米颗粒上。
46、将混合物置于外加磁场中，结合了外泌体的磁性纳米颗粒被磁铁吸引并与溶液分离，而未结合的杂质组分则留在上清中；
47、移除上清，向磁性纳米颗粒中加入洗涤缓冲液，重复洗涤数次，去除残留杂质；
48、向洗涤后的磁性纳米颗粒中加入洗脱缓冲液，孵育，使外泌体从抗体上解离；
49、将混合物再次置于磁场中，磁性纳米颗粒被吸附，而游离的外泌体则留在上清中；
50、转移上清至新的离心管中，即得到富集的高纯度外泌体制剂。
51、一种脐带源间充质干细胞外泌体的应用，其应用于治疗癌症的药物中。
52、本发明的有益效果在于：本发明提出的一种脐带源间充质干细胞外泌体的制备方法可显著提高外泌体制备的效率、纯度和生物活性。
53、利用人脂肪组织支架可为细胞提供更接近体内的生长微环境，促进其增殖和分化，提高外泌体的分泌效率。
54、超临界流体具有类似气体的高渗透性和类似液体的高溶解性，可深入细胞内部，选择性提取外泌体，超临界流体技术可在温和条件下高效提取外泌体，保持其天然生物学特性。
55、微流控芯片可自动化、高效率地完成外泌体的分离纯化，显著提高外泌体纯度，同时减少样品损失。
56、磁性纳米颗粒技术可实现外泌体的高特异性富集，进一步提高制剂纯度。
1.一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s1中，人脂肪组织支架的制备过程为：
3.根据权利要求2所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s12中，脱细胞处理的具体过程为：
4.根据权利要求3所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s1中，首先取新鲜脐带组织，采用胶原酶消化法分离得到间充质干细胞；将细胞悬液以106个/ml的密度接种到人脂肪组织支架上，置于37℃、5% co2的细胞培养箱中培养，采用无血清、低葡萄糖dmem培养基，添加bfgf、egf等生长因子，每2-3天更换培养基，培养2-3周直至细胞铺满人脂肪组织支架。
5.根据权利要求1所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s2中，超临界流体提取装置包括高压泵、提取罐、分离罐、压力和温度控制系统。将步骤s1中的人脂肪组织支架置于在提取罐中，通过高压泵引入超临界二氧化碳流体；
6.根据权利要求1所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s3中，微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（pdms）材料，利用软光刻手段制成；
7.根据权利要求6所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s3中，纯化外泌体的流程为：取步骤s2中超临界流体提取的外泌体悬浮液，以20μl/min流速导入微流控芯片；
8.根据权利要求1所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s4中，功能化磁性纳米颗粒的制备过程如下：
9.根据权利要求8所述的一种脐带源间充质干细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤s4中，将纯化后的外泌体悬浮液与功能化磁性纳米颗粒混合，孵育30分钟至3小时；
10.一种脐带源间充质干细胞外泌体的应用，其特征在于，其应用于治疗癌症的药物中。
