本发明涉及基因突变检测，具体为npm1基因突变检测引物组、试剂盒及应用。
背景技术：
1、npm1基因突变在血液肿瘤临床非常常见，发生在大约30％的成人急性髓系白血病（aml）病例中，在正常核型的aml病例中可达到50-60％，是aml最常见的分子异常之一。自从2005年发现npm1突变以来，已经描述了超过55种不同的突变亚型，主要发生在12号外显子中，突变类型以4个碱基的插入为主，三种主要突变类型（a型插入tctg、b型插入catg和d型插入cctg）占所有病例的95％。npm1基因突变在整个疾病过程中通常是稳定的，长期以来一直认为带有npm1突变的患者在复发时几乎总是稳定存在，其在疾病发展过程中的稳定性并且与疾病状况的密切相关性使它成为监测微小残留病（mrd）的理想标志物。
2、目前常用于临床检测npm1基因突变的方法主要有一代测序（sanger测序）法和采用taqman双色荧光基团标记探针的荧光定量pcr法和数字pcr法。
3、一代测序检测环节包含核酸提取、pcr扩增、核酸纯化、凝胶电泳、上机测序和结果分析等，实验流程步骤多、耗时长，其次一代测序检测灵敏度低、不能定量、且检测下限仅为10%，意味着患者体内存在10%以下的肿瘤细胞都不能有效检出，不适合用于复杂背景噪音的标本中检测微小残留病（mrd），因此不具备提示早期复发并指导临床进行预防性治疗的作用。
4、在荧光定量pcr检测npm1基因突变的方法中，检测特异性和灵敏度相对于一代测序都有所提升，但这种检测方法也有不尽如人意的方面，首先需要明确突变位点的类型，并针对已知的突变类型单独设计相应的引物和探针，其使用的taqman双端标记荧光基团探针的价格较贵，通用性差，检测体系中引物探针繁多容易产生操作误差和增加交叉差污染的几率；其次，荧光定量pcr在定量时都需要针对特定突变型别合成质粒作为参考品，并建立标准曲线，核酸样本中的如存在抑制剂或引物扩增效率都会对定量检测结果产生干扰。还有一点需要说明的是，荧光定量pcr检测npm1突变的标本需要提取rna，并逆转录为cdna后进行检测，单链rna相对于双链dna并不稳定，对样本的质量要求较高，同时相比使用dna直接作为模板进行定量的方法需要额外支出rna提取和逆转录的试剂成本。
5、微滴数字pcr(ddpcr)是一种新型的核酸分子定量检测技术，通过微滴发生器将pcr反应体系中的核酸样本随机分装进数万个独立的纳升级油包水液滴，每个微滴都是独立的pcr微反应器，反应结束后，使用微滴检测器逐一检测每个微滴的荧光信号，根据荧光信号的强弱，将微滴分为阳性微滴和阴性微滴，实现了无需标准物质即可直接测量样品中靶分子拷贝数的绝对定量，并进一步提高了检测的准确性和灵敏度。ddpcr不足之处在于其引物探针的设计要求与荧光定量pcr如出一辙，引物探针设计及管理流程复杂，双标探针昂贵导致检测成本居高，因此推动其进一步商业化的一个有效且优选的方案就需要简化实验设计和操作流程、降低样本要求及检测成本。
6、竞争性等位基因pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对snp和特定位点上的indel进行精准的双等位基因判断。上游引物为特异性引物，3′端为等位变异碱基，5′端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，终点法荧光信号检测，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害，只需要借助荧光定量pcr仪运行扫描程序即可。该技术准确率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针，最低的dna样本需求，无需全基因组扩增，可快速高效地鉴定基因型别。该技术现阶段主要被应用于snp基因分型研究中，是分子标记辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要手段。
7、目前尚未见利用kasp技术体外检测血液肿瘤微小残留病（mrd）的报道，亦未见其应用于数字pcr平台定量检测indel基因突变的报道。
8、基于此，有必要通过研究并基于kasp技术设计引物组，创新性的与液滴式数字pcr相结合，开发出一种简洁、高效、成本低、定量精度高检测方法来解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明提出npm1基因突变检测引物组、试剂盒及应用，基于kasp技术设计得到npm1基因突变检测引物组，可实现kasp技术结合数字pcr检测体外检测血液肿瘤基因突变，克服现有检测流程繁琐、灵敏度低、成本高的缺陷。
2、有鉴于此，本发明的方案为：
3、本发明的第一个方面，提供用于检测npm1基因突变的引物组，采用kasp方法设计，包括3条分别用于检测npm1基因a、b、d三种突变型的上游引物、1条用于检测npm1基因突变的野生型引物，以及1条通用下游引物组成的4条引物对；其中：
4、所述用于检测npm1基因a型突变引物的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述用于检测npm1基因b型突变引物的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述用于检测npm1基因d型突变引物的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述用于检测npm1基因野生型引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示。
5、本发明的第二个方面，提供第一个方面所述引物组在制备npm1基因突变检测产品中的应用。
6、本发明的第三个方面，提供试剂盒，用于检测npm1基因突变，包括以上第一个方面所述的引物组。
7、进一步，所述试剂盒还包括kasp master mix、阳性标准品、阴性标准品、和ddh2o。
8、进一步，所述引物组中各引物对浓度均为6-9μm。
9、本发明第四个方面，提出第三个方面所述试剂盒在非诊断为目的检测npm1基因突变中的应用。
10、上述检测方法中，非诊断为目的的检测包括无法追溯至人的样本的检测，检测结果代表样本自身结果，可以同时实现检测结果的定性和定量，即npm1基因a/b/d三种型别的突变存在与否及所占总细胞的比例。
11、本发明第五个方面，提出一种非诊断目的检测npm1基因突变的方法，步骤包括：
12、s1.提取样品中基因组dna；
13、s2.将样品dna、第一个方面所述的引物组、以及kasp master mix、ddh2o混合，制备成kasp反应混合液；
14、s3.将kasp反应混合液制成ddpcr微反应液滴，进行数字pcr扩增反应；
15、s4.对pcr扩增反应产物进行荧光信号的采集，根据荧光信号的类型判断npm1基因突变情况。
16、进一步地，步骤s1中，所述样品可来源于全血或骨髓，基因组dna核酸浓度应该满足检测要求。
17、进一步地，步骤s2中，所述用于检测npm1基因突变的引物浓度均为6～9μm。
18、进一步地，步骤s3中，所述ddpcr混合液加入到数字pcr仪中，将ddpcr混合液制成15000-20000个微反应液滴。
19、进一步地，步骤s3中，所述pcr扩增反应程序如下：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火45s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火45s，30个循环。
20、进一步地，步骤s4中，所述pcr扩增结束后，对液滴信号进行检测，采集的荧光信号通道包括fam和vic，fam作为检测npm1突变型的荧光信号通道，vic作为检测npm1野生型的荧光信号通道。
21、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
22、本发明提出基于kasp技术设计得到npm1基因突变检测引物组，通过在5’端设计独特接头序列，以及3’端设计4个bp碱基的差异使得引物对pcr模板具有较好的特异性，可实现kasp技术结合数字pcr检测血液肿瘤基因突变，结合发挥了kasp的低成本优势和数字pcr的高灵敏度和准确性的优势，开拓了kasp技术的应用范围和商业前景。
23、本发明所述的检测流程简洁高效且灵敏度高，克服了一代测序的流程繁琐和灵敏度低的缺陷，适合于血液肿瘤复杂背景噪音的标本中检测微小残留病（mrd）。
24、本发明直接使用dna作为检测模板，降低了样本的质量要求，减少了rna提取和逆转录的试剂成本。
25、本发明实现了对npm1基因突变的绝对定量，不依赖于参考物或标准品，摆脱了荧光pcr中抑制物或扩增效率对ct值的不确定性影响，定量结果更加准确可靠。
26、本发明为多重数字pcr反应体系，多条引物在单个pcr孔中进行反应即可实现npm1基因a/b/d三种突变型别的定性/定量检测。
27、本发明使用kasp技术中的通用探针，不需要针对每种型别单独设计昂贵的双色标记探针，有效降低检测成本和患者的费用负担，具有较强的市场竞争力。
1.npm1基因突变检测引物组，其特征在于，包括由核苷酸序列如seq id no：1-4所示的上游引物，及核苷酸序列如seq id no：5所示的通用下游引物组成的4条引物对。
2.权利要求1所述引物组在制备npm1基因突变检测产品中的应用。
3.试剂盒，用于检测npm1基因突变，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括kasp master mix、阳性标准品、阴性标准品和ddh2o。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述kasp master mix包含通用性荧光探针。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中各引物浓度均为6-9μm。
7.权利要求3-6任意一项所述试剂盒在非诊断为目的检测npm1基因突变中的应用。
8.一种非诊断目的检测npm1基因突变的方法，其特征在于，包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品来源于全血或骨髓。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述kasp反应混合液，加入到液滴式数字pcr仪中，制成15000-20000个微反应液滴；和/或，所述pcr扩增反应程序如下：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火45s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火45s，30个循环；
