本发明涉及一种酶活性提高的氧甲基转移突变体，并利用该突变体构建相应代谢产物的生物合成底盘，属于酶工程和合成生物学领域。
背景技术：
1、7-氧甲基转移酶（coclaurine 7-o-methyltransferase，7-omt）是一种催化乌药碱c7位羟基甲基化的氧甲基转移酶，是苄基异喹啉类生物碱合成过程中的一种关键酶，催化产物去甲亚美罂粟碱是亚美罂粟碱的直接前体化合物，对相关苄基异喹啉类生物碱的生物合成起着重要作用。
2、来源于粉防己的一条7omt基因，利用基因工程技术，构建了含有st7omt基因的大肠杆菌重组菌株，实现了st7omt蛋白表达。进行体外酶催化活性验证，证实了该st7omt具有催化c7位羟基甲基化的功能，为相关代谢产物的生物合成提供了一条7omt酶学元件，但是经体外催化验证发现其催化活性偏低，产物转化率低，严重限制了相关代谢产物的催化合成。
3、亚美罂粟碱是一种来自 nelumbo nucifera的活性化合物，不仅对人外周血单核细胞具有抗炎作用，且对t淋巴细胞和狼疮肾炎小鼠也具有免疫抑制作用，还具有抑制tnf-α诱导的mapk和nf-κb信号级联反应。
4、本发明基于前期已构建的st7omt重组质粒，通过点突变改变蛋白质的腔体通道，经大肠杆菌诱导表达，从而实现了st7omt酶活的提高和底物特异性的改变，并利用上述已改造的7omt质粒，以此构建亚美罂粟碱生物合成底盘。
技术实现思路
1、本发明目的在于利用从药用植物粉防己中鉴定的7omt基因（命名为st7omt），利用大肠杆菌对该基因进行异源重组表达，并利用定点突变技术获得酶活性提高的氧甲基转移酶突变体，并公开其在产物合成方面的应用。
2、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
3、本发明利用来源于药用植物粉防己的野生型st7omt基因（氨基酸序列如seq idno.1所示），通过大肠杆菌异源表达体系，实现了c7羟基甲基化的催化功能验证。此外，本发明还提供一种提高氧甲基转移酶活力的方法，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的氧甲基转移酶蛋白质分子内部第118位丙氨酸突变为缬氨酸；121位的谷氨酰胺分别突变为亮氨酸或缬氨酸；同时将第151位的精氨酸突变为亮氨酸或者异亮氨酸。所述突变体选自如下的任一种：
4、a118v：将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸；
5、q121l：将第121位谷氨酰胺定向突变为亮氨酸；
6、q121v：将第121位谷氨酰胺定向突变为缬氨酸；
7、r151l：将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸；
8、r151i：将第151位的精氨酸定向突变为异亮氨酸；
9、a118v/r151l：将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸；
10、a118v/r151i：将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变为异亮氨酸；
11、q121v/r151l：将第121位谷氨酰胺定向突变为缬氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸；
12、q121v/r151i：将第121位谷氨酰胺定向突变为缬氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变为异亮氨酸；
13、q121l/r151l：将第121位谷氨酰胺定向突变为亮氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸；
14、q121l/r151i：将第121位谷氨酰胺定向突变为亮氨酸的同时将第151位的精氨酸定向突变异亮氨酸；
15、a118v/q121l：将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸的同时将第121位的谷氨酰胺定向突变为亮氨酸；
16、a118v/q121v：将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸的同时将第121位的谷氨酰胺定向突变为缬氨酸；
17、a118v/q121l/r151l：同时将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸、将第121位谷氨酰胺定向突变为亮氨酸、将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸；
18、a118v/q121l/r151i：同时将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸、将第121位谷氨酰胺定向突变为亮氨酸、将第151位的精氨酸定向突变为异亮氨酸；
19、a118v/q121v/r151l：同时将第118位丙氨酸定向突变为缬氨酸、将第121位谷氨酰胺定向突变为缬氨酸、将第151位的精氨酸定向突变为亮氨酸。
20、在本发明的一种实施方式中，将含有编码氧甲基转移酶的基因与载体pgex-4t-1连接，转化大肠杆菌 e. coli bl21(de3)。挑选转化子接种到带有amp抗性的lb液体培养基中，37℃培养12 h，转接到新的抗性培养基中，接种量为1%。待菌体长到od600为0.6-0.8时，加入iptg诱导，并将培养温度降到16℃，培养24 h。收集上清，纯化获得氧甲基转移酶突变体。
21、本发明通过定点突变的方式，将氧甲基转移酶分子内部亲水性的氨基酸谷氨酰胺突变成疏水性强的亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸改变了分子内部疏水性和底物相互作用，并且重塑底物口袋和底物进出通道，显著提高菌株表达氧甲基转移酶的酶活性，并将氧甲基转移酶活提高了约2-6倍，同时产生催化氮甲基乌药碱c7位羟基催化作用，通过引入ps6omt和pscnmt基因，完成亚美罂粟碱生物合成底盘的构建。
1.一种酶活性提高的氧甲基转移酶突变体，其特征在于：是将氨基酸序列如seq idno.1所示的氧甲基转移酶第121位的谷氨酰胺突变为亮氨酸或缬氨酸；和/或将118位丙氨酸突变为缬氨酸；和/或将第151位的精氨酸分别突变为亮氨酸或者异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的酶活性提高的氧甲基转移酶突变体，其特征在于：氧甲基转移酶突变体的氨基酸序列分别如seq id no.2-17所示。
3.一种权利要求1所述氧甲基转移酶突变体在苄基异喹啉类生物碱合成中的应用。
4.根据权利要求3的应用，在苄基异喹啉类生物碱合成中，氧甲基转移酶突变体催化c7羟基甲基化。
5.根据权利要求3的应用，所述苄基异喹啉类生物碱为亚美罂粟碱。
6.一种提高氧甲基转移酶活性的方法，其特征在于：是将氨基酸序列如seq id no.1所示的氧甲基转移酶蛋白质分子内部第121位的谷氨酰胺突变为亮氨酸或缬氨酸；和/或将118位丙氨酸突变为缬氨酸；和/或将第151位的精氨酸突变为亮氨酸或者异亮氨酸。
7.一种苄基异喹啉类生物碱的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求1所述的突变体基因在大肠杆菌中表达，以构建苄基异喹啉类生物碱生物合成底盘。
8.根据权利要求7所述的苄基异喹啉类生物碱的合成方法，其特征在于：将6omt、cnmt及权利要求1所述的突变体基因同时在大肠杆菌中表达。
9.根据权利要求7所述的苄基异喹啉类生物碱的合成方法，其特征在于：所述苄基异喹啉类生物碱为亚美罂粟碱。
10.一种苄基异喹啉类生物碱生物合成底盘，其特征在于：将权利要求1所述的突变体基因在大肠杆菌中表达，以构建苄基异喹啉类生物碱生物合成底盘。
