本发明属于基因工程，具体涉及一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因及在抗旱中的应用。
背景技术：
1、植物在自然环境中生长，常受到来自外界的非生物胁迫，干旱是最常见的胁迫之一，其影响植物的产量，干旱对全球作物产量的影响约是其他非生物胁迫影响的总和。水孔蛋白(aquaporin)作为水分运输的媒介在植物响应干旱胁迫中扮演着重要作用。植物液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,tips)可以调控液泡膜对植物体内水分及其他小分子物质的跨膜运输，是水孔蛋白的一个重要分类。因此，对水孔蛋白的功能及机理进行分析，对改良植物的抗干旱能力具有重要意义。
2、在水分转运过程中，tip基因大量表达，这表明tips对植物水分平衡的调控起着重要作用。水孔蛋白被认为是植物中主要的水转运蛋白，水孔蛋白的分布和表达可能会因为物种的差异而不同。目前，对tips基因的关注较少，基因功能的研究也不足，关于tips抗旱功能的研究报导也是比较少，许多tips基因的抗旱功能和抗旱机制仍不明确，因此需要加大对植物液泡膜内在蛋白的相关研究，丰富和完善tips抗旱调控机制。
3、白三叶(trifolium repens l.)是一种多年生冷季型豆科牧草，也是温带地区建坪的主要草种。但是，其根系较短，调控蒸腾能力低，缺水时容易发病，在各种非生物和生物因素的干扰下，白三叶品质和外观表现被严重影响。因此，越来越多的学者开始关注于白三叶抗逆方面的研究，对逆境相关基因的挖掘和功能解析，也逐步成为该领域研究的一个重点。在白三叶抗旱研究方面，一些功能基因的研究已经取得了突破，但前人的研究对于白三叶自身基因的挖掘不足，相关抗旱调控机制研究较少，需要进一步研究。
技术实现思路
1、本发明为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因及在抗旱中的应用。本发明通过生理性状实验和遗传分子学操作，证明白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因编码定位于液泡膜的水孔蛋白，并且可能通过水分运输的特异性来响应植物干旱过程。本发明所述的白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因，是在前期实验的基础上通过壳聚糖外施转录组数据分析筛选得到的可能具有提高白三叶耐旱性的功能基因。
2、本发明的一个目的是提供一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列，以及白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因编码的氨基酸序列；本发明的另一个目的是提供一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列在提高植物抗干旱性能中的应用。
3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
4、第一方面，本发明提供一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列，其特征在于，所述基因序列为下述1)-3)中的任一种：
5、1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；
6、2)具有与seq id no.1所示的核苷酸序列90％以上同源性，且编码相同功能蛋白的核苷酸序列；
7、3)编码与seq id no.2所示氨基酸序列组成的蛋白有相同功能蛋白的核苷酸序列。
8、seq id no.1所示的核苷酸序列具体为：
9、ctgggcgggctaggacacaagatggcctctttcccaatcatatacattttattattgtaaactcttcatatataataccatagcaaagaattcttatgcaagacatcaattaatagttgattagataggttcaaaacacattagtcttaagttaataagctagctctccttagttttcaagtgatttcccaaaatggtgaagataacttttggtacatttgatgactcttttagcattgcttcccttaaggcatatctatcagagttcattgccactctgatttttgtgtttgcaggagttggatcagccattgcttacaatgagcttacatcagatgcagccttggatccatcaggtctagtggcagtagccgtggctcatggatttgcactatttgttggtgtggccatcgcagccaacatctcaggtggacatttgaacccagctgtcacttttggattagctattggaggcaacatcaccatcctaactggtttcttctattggattgcccaattgcttggttccattgttgcatctctcctcctcaattatgtcacctctaagagtgttccaacccatggagtggctgctggattgaaccctattgcaggattagtatttgagattattataacatttgggttggtttacactgtttatgccacagcagctgaccccaaaaagggttcaattggcaccattgcacccattgctattggtttcgttgtgggtgccaacatcttagcagccggtccattcagcggcggatcaatgaacccggctcgctcattcggtccagctgtggtcagtggaaacttttctgataactggatctactgggttggtccattgataggaggaggcttggctgggttgatttatggtgacatattcattggttcatatgccccagcaccatcatctgaaacatacccttaagaatgaattaatctttgttcactgtttgcttgttgtcttgaacctcttgggttttttctttcaaaaacagaaagttgtaacttttatcatcaatccatgctgctgtaataaattgtaaataaaagtagaatgtggseq id no.2所示的氨基酸序列具体为：
10、mvkitfgtfddsfsiaslkaylsefiatlifvfagvgsaiayneltsdaaldp
11、sglvavavahgfalfvgvaiaanisgghlnpavtfglaiggnitiltgffywia
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14、第二方面，本发明提供一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述1)-2)中的任一种：
15、1)如seq id no.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
16、2)seq id no.2氨基酸序列经过1个或两个以上氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no.2氨基酸序列组成蛋白具有相同功能的蛋白质。
17、第三方面，本发明提供一种如上所述的白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列在培育转基因抗旱植物中的应用。
18、所述植物为拟南芥、白三叶。
19、第四方面，本发明提供一种转基因抗旱植株的培育方法，其特征在于，利用基因工程技术，将白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因在植株中进行过表达，得到转基因抗旱植株。
20、所述基因工程技术可采用本领域中已记载的导入基因的技术手段，如利用农杆菌介导的花序浸染法、重组质粒、重组菌、转基因细胞系或表达盒等技术对导入基因实现过表达。
21、在本发明的具体实施方式中，所述基因工程技术为农杆菌介导的花序浸染法。
22、优选的，所述培育方法包括如下操作：
23、(1)设计特异性引物对，以白三叶品种“拉丁诺”为材料，克隆出编码液泡膜内在蛋白trtip2-2的基因序列，并推导其编码的氨基酸序列。
24、(2)通过实时荧光定量pcr验证液泡膜内在蛋白trtip2-2基因的转录本在干旱、h2o2、aba和cacl2处理下的表达模式；
25、(3)将液泡膜内在蛋白trtip2-2的基因序列通过农杆菌介导的花序浸染法过表达到植株中，得到转基因抗旱植株。
26、具体的，所述步骤(1)包括：
27、(a)以白三叶叶片总rna进行反转录反应，获取cdna，设计特异性引物，进行rt-pcr反应，获得如seq id no.1所示的核苷酸序列；
28、(b)预测开放阅读框，推导所述基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
29、优选的，所述特异性引物对为：
30、trtip2-2 1f(seq id no.3)：5’-aattcttatgcaaggcatcttcaat-3’
31、trtip2-2 1r(seq id no.4)：5’-tcagatcaaaaacaaagggaccttc-3’。
32、所述步骤(3)包括：
33、(a)将液泡膜内在蛋白trtip2-2基因重组到pml-cambia3300载体骨架上，筛选、鉴定，获得植物过表达重组载体；
34、(b)采用冻融法转化植物过表达重组载体至农杆菌，制备转染用菌液；
35、(c)采用花序侵染法将植物过表达重组载体转化至植株。
36、本发明的有益效果是：
37、本发明通过设计特异性引物，以白三叶品种“拉丁诺”为材料，克隆出一个编码液泡膜内在蛋白trtip2-2的基因，并推导其编码的氨基酸序列。本发明提供的白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因具有潜在的抗干旱以及过氧化胁迫的能力。
38、通过实时荧光定量pcr验证trtip2-2转录本在干旱、h2o2、aba和cacl2处理下的表达模式，结果表明该编码序列在上述四种处理下，根与叶中的表达量均发生了显著的变化，trtip2-2基因的转录水平均有明显升高。
39、进一步的，将白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因过表达至拟南芥中，转基因植株在干旱胁迫下表现出明显的抗旱性，且水分亏缺情况下具有更高的光合能力与抗氧化酶活性，对培育抗干旱胁迫能力的植株具有重要意义。
1.一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列，其特征在于，所述基因序列为下述1)-3)中的任一种：
2.一种白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述1)-2)中的任一种：
3.一种权利要求1所述的白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因序列在培育转基因抗旱植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥、白三叶。
5.一种转基因抗旱植株的培育方法，其特征在于，利用基因工程技术，将权利要求1所述的白三叶液泡膜内在蛋白trtip2-2基因在植株中进行过表达，得到转基因抗旱植株。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述基因工程技术选自农杆菌介导的花序浸染法、重组质粒、重组菌、转基因细胞系或表达盒技术。
7.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括如下操作：
8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：
9.根据权利要求8所述的培育方法，其特征在于，所述特异性引物对为：
10.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：
