本发明涉及一种高效复合脱毒的方法，尤其涉及一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其属于植物病毒防治。
背景技术：
1、葡萄是深受全世界人们喜爱的水果，它的品种多，经济价值高，栽培历史悠久。全世界葡萄的栽培面积1000万hm2，产量近6000万t。尽管葡萄产业发展迅速，但也面临很多问题。葡萄是一个易感病的树种，特别是葡萄病毒病，其病毒的种类多、分布广、危害也大。病毒病在我国酿酒葡萄上发生普遍，其可造成品种退化、树势衰弱、抗逆性减弱等危害，从而导致果实品质下降、经济寿命缩短、嫁接成活率降低等危害，造成重大经济损失。葡萄病毒主要随苗木、砧木、接穗、插条等营养繁殖材料传播扩散，染病植株终生带毒，持久危害，且无法通过化学药剂进行防治。培育和栽植健康的无病毒苗木是防治葡萄病毒病的根本措施。
2、葡萄脱毒常用方法包括茎尖培养、热处理结合茎尖培养、化学疗法、超低温结合茎尖组织培养法，其中以茎尖培养应用最为广泛。茎尖培养是目前应用最广泛的脱毒方法之一，其原理是根据植物茎尖内病毒含量很低或不含病毒的特点，利用茎尖为外植体进行组织培养获得无毒苗木。茎尖培养脱毒技术受茎尖大小的限制，脱毒的成功率与所切下茎尖分生组织的大小成反比，而茎尖离体培养再生率与茎尖大小成正比，但太小的茎尖分生组织再生成植株较困难，因而限制了茎尖培养脱毒技术的使用。因此，采用适当大小的茎尖进行离体培养，是脱毒成功与否的关键因素。
3、热处理脱毒主要是指应用不影响寄主植物正常生长的高温，利用病毒在高温下不稳定的特点，将携带病毒的葡萄植株或组织器官在高温下进行培养，包括恒温处理和变温处理两种方式。热处理脱毒技术的局限是在于并非所有病毒都对热处理敏感，一般对球状的病毒(如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒)或线状的病毒(如马铃薯x、y病毒及康乃馨病毒)有效果，而对杆状病毒(如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒)效果甚微。
4、化学疗法能够不同程度地脱除植物病毒，可在某种程度抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但尚不能完全抑制病毒使其失活。化学疗法使用的病毒抑制剂主要是通过延迟或抑制病毒的复制而发挥作用(defazio g et al.1978)。目前主要的病毒抑制剂有病毒唑、板蓝根、鸟嘌呤和尿嘧啶类等多种物质，在植物组织培养过程中，在培养基中加入适当的病毒抑制剂，可以达到脱除外植体病毒的效果。
5、超低温结合茎尖组织培养法是一种新建立的脱毒方法，近年来基于超低温保存技术建立的一种新型的生物脱毒技术(bettoni et al.2016；feng etal.2013；yin etal.2011；wang et al.2009,2014)，它的基本原理是植物茎尖在经过液氮处理后，带病毒区域的细胞被杀死，不带病毒的细胞成活再生的过程。研究发现其脱毒率不受茎尖大小的影响，也不受冷冻方法的影响，取材容易，脱毒速度快而简单，也能取得较高的脱毒率，超低温处理这种新兴的技术在脱毒效率上占有优势，而且操作起来更方便，是极有发展潜力的脱毒新技术。但是，超低温脱毒技术也存在种间差异大、茎尖成活率低的问题，且超低温脱毒技术尚未完备，脱毒一体化进程有待进一步优化。因此，亟需一种便捷实用、简单易行的高效脱毒方法，能够最大程度上提高脱毒效率，降低成本。
技术实现思路
1、技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，此方法效率脱毒效率大幅提高、可同时高效脱除不同品种的多种病毒，操作简单、快速有效，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。
2、技术方案：为实现上述目的，本发明公开的一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，包括以下步骤：
3、步骤s1、携带病毒的植物材料的采集：对经过病毒检测的具有病毒的植物材料进行外植体采集；
4、步骤s2、将外植体消毒进行初代培养，获得无菌组培苗；
5、步骤s3、增值生根培养：将步骤s2获得的无菌组培苗切取2cm以上带有2个新生芽的茎段剪下，并接种于增殖生根1/2ms培养基中，每隔28～30d继代一次，获得足够的组培苗，用于脱毒处理材料；
6、步骤s4、葡萄组培苗病毒检测：利用反转录聚合酶链反应方法对步骤s3组培苗进行葡萄病毒检测；
7、步骤s5、葡萄组培苗茎尖热处理：切取步骤s3中组培苗带叶单芽茎段，接种后在继代培养基上，25±2℃培养15天，升温至32℃预处理2d，之后升温至35℃预处理2d，然后升温至38℃热处理，处理方式为38℃/光照8h+32℃/黑暗8h，依次循环，热处理培养30d后，选取大小为1.0mm的腋芽茎尖进行超低温脱毒；
8、步骤s6、超低温脱毒：在预培养培养基中遮光培养3d，经预培养基培养的茎尖在室温下用加载液处理20min，然后分别用1/2浓度的pvs2和pvs2在冰上处理30min和50min后，将脱水后的茎尖转入铝箔条上的pvs2小滴中，制成pvs2小滴，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖，转移至0.8×2.0cm的铝箔条上，将所述载有冷冻保护剂滴包裹的茎尖的铝箔条放入液氮中5min；保存后，迅速将携带茎尖的铝箔条转移至卸载液中进行解冻和卸载20min，然后将腋芽转移至恢复培养基上遮光培养24h后，正常光照下培养，再转移至后培养基上培养。
9、步骤s7、葡萄组培苗二次病毒检测：利用反转录聚合酶链反应方法对步骤s6中组培苗进行葡萄病毒检测。
10、更进一步的，在步骤s6中，所述预培养培养基为ms+0.16um谷胱甘肽+0.14um抗坏血酸。
11、更进一步的，在步骤s6中，所述加载液为2m甘油+0.4m蔗糖，所述卸载液为1.2m蔗糖。
12、更进一步的，在步骤s6中，所述pvs2的成分为：1/2ms、30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)二甲基亚砜和0.4m蔗糖；所述1/2浓度的pvs2成分为：1/2ms+15％(w/v)甘油+7.5％(w/v)乙二醇+7.5％(w/v)二甲基亚砜+0.4m蔗糖。
13、更进一步的，在步骤s6中，所述恢复培养基为1/2ms+0.6m蔗糖+7g l-1琼脂；所述后培养基为ms+0.5mg l-1ba。
14、本发明采用热处理结合超低温脱毒技术，与传统脱毒方法相比，其脱毒效率大幅提高，可同时高效脱除不同品种的多种病毒，操作简单、快速有效，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。
1.一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于：在步骤s6中，所述预培养培养基为ms+0.16um谷胱甘肽+0.14um抗坏血酸。
3.根据权利要求1所述的酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于：在步骤s6中，所述加载液为2m甘油+0.4m蔗糖，所述卸载液为1.2m蔗糖。
4.根据权利要求1所述的酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于：在步骤s6中，所述pvs2的成分为：1/2ms、30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)二甲基亚砜和0.4m蔗糖；所述1/2浓度的pvs2成分为：1/2ms+15％(w/v)甘油+7.5％(w/v)乙二醇+7.5％(w/v)二甲基亚砜+0.4m蔗糖。
5.根据权利要求1所述的酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于：在步骤s6中，所述恢复培养基为1/2ms+0.6m蔗糖+7g l-1琼脂；所述后培养基为ms+0.5mg l-1ba。
