本技术涉及核酸检测相关，具体提供了一种检测猪病毒性腹泻病原体的引物探针组合物及其用途。
背景技术：
1、猪病毒性腹泻的流行具有一定的季节性，猪病毒性腹泻多发于春秋季节。随着养殖环境与养殖方法的优化，也使得猪病毒性腹泻的发病季节性逐渐淡化，部分养猪场夏季也会发生该病。处于哺乳期的仔猪因免疫系统尚处于发育阶段，因此对病毒的抵抗力较弱，导致仔猪的发病症状比其他年龄段的猪症状更为严重；猪病毒性腹泻的传播途径有多种，其中消化道传播是主要的传播途径，被污染的饲料、饮水、环境等都是传播媒介，此外，呼吸道传播和垂直传播等也是猪病毒性腹泻的传播途径。
2、在一些规模化、集约化的养猪场，因生猪密度大且流动性强，若发生疫情，很难迅速控制，因此养殖规模的扩大在一定程度上也使猪病毒性腹泻的发病率有所上升；猪病毒性腹泻的病原也逐渐复杂化，猪可以同时感染多种病毒，进而加重症状表现，使病情严重，同时，病毒的变异增加了猪病毒性腹泻的防控难度。
3、因此，加强对猪轮状病毒(porcine rotavirus，简称rv)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，简称pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis virus，简称tgev)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，简称pdcov)、猪细小病毒(porcine pamo virus，简称ppv)、非洲猪瘟病毒(african swinefever virus，简称asfv)、猪急性腹泻综合征病毒(porcine acute diarrhea syndromevirus，简称sads-cov)和产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，简称cp)在内的具有强致病性和传染性的猪病毒性腹泻类疾病的防制刻不容缓。
4、首当其冲，建立一种便捷、快速、经济的猪病毒性腹泻类疾病的检测方法用于临床诊断就显得极为必要。传统检测方法是需要针对某一种病原体单独检测，大大增加检测过程中的物料成本及检测人员的时间成本。因此，建立一种稳定且高效，经济且便捷的猪病毒性腹泻病原体的八联rt-pcr检测技术对于临床生产价值巨大。
技术实现思路
1、鉴于此，本技术提供一种检测猪病毒性腹泻病原体的引物探针组合物及其用途。
2、在本技术的第一方面，本技术提供了一种检测猪病毒性腹泻病原体的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括：
3、(i)、具有如seq id no.1、4、7、10、13、16、19、22所示核苷酸序列的上游引物；和/或，具有如seq id no.1、4、7、10、13、16、19、22中任意所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能相同或相似；
4、(ii)、具有如seq id no.2、5、8、11、14、17、20、23所示核苷酸序列的下游引物；和/或，具有如seq id no.2、5、8、11、14、17、20、23中任意所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能相同或相似；
5、(iii)、具有如seq id no.3、6、9、12、15、18、21、24所示核苷酸序列的探针；和/或，具有如seq id no.3、6、9、12、15、18、21、24中任意所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能相同或相似。
6、在一些实施方式中，所述引物探针组合物包括：
7、(i)、具有如seq id no.1、4、7、10、13、16、19、22所示核苷酸序列的上游引物；
8、(ii)、具有如seq id no.2、5、8、11、14、17、20、23所示核苷酸序列的下游引物；
9、(iii)、具有如seq id no.3、6、9、12、15、18、21、24所示核苷酸序列的探针。
10、其中，具有如seq id no.1所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.2所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.3所示核苷酸序列的探针用于检测猪轮状病毒。
11、具有如seq id no.4所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.5所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.6所示核苷酸序列的探针用于检测猪流行性腹泻病毒。
12、具有如seq id no.7所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.8所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.9所示核苷酸序列的探针用于检测猪传染性胃肠炎病毒。
13、具有如seq id no.10所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.11所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.12所示核苷酸序列的探针用于检测猪德尔塔冠状病毒。
14、具有如seq id no.13所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.14所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.15所示核苷酸序列的探针用于检测猪细小病毒。
15、具有如seq id no.16所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.17所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.18所示核苷酸序列的探针用于检测非洲猪瘟病毒。
16、具有如seq id no.19所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.20所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.21所示核苷酸序列的探针用于检测猪急性腹泻综合征病毒。
17、具有如seq id no.22所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no.23所示核苷酸序列的下游引物、及具有如seq id no.24所示核苷酸序列的探针用于检测产气荚膜梭菌。
18、在一些实施方式中，每条所述探针的5'末端和3'末端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。其中，八条所述探针的5'末端修饰的荧光基团相同或不同。若八条所述探针的5'末端修饰的荧光基团相同，则八管八联检测；若八条所述探针的5'末端修饰的荧光基团两两相同，则两管八联检测；若八条所述探针的5'末端修饰的荧光基团各不相同，则一管八联检测。
19、在一些实施方式中，所述荧光基团包括fam荧光基团、vic荧光基团、texas red荧光基团、cy5荧光基团、fam荧光基团、rox荧光基团中的至少一种；
20、在一些实施方式中，所述淬灭基团包括bhq1淬灭基团、bhq2淬灭基团、mgb淬灭基团、tamra淬灭基团中的至少一种。
21、在一些实施方式中，具有如seq id no.3所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有fam荧光基团、3'末端修饰有bhq1淬灭基团；
22、和/或，具有如seq id no.6所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有texas red荧光基团、3'末端修饰有bhq2淬灭基团；
23、和/或，具有如seq id no.9所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有vic荧光基团、3'末端修饰有bhq1淬灭基团；
24、和/或，具有如seq id no.12所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有cy5荧光基团、3'末端修饰有bhq2淬灭基团；
25、和/或，具有如seq id no.15所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有fam荧光基团、3'末端修饰有bhq1淬灭基团；
26、和/或，具有如seq id no.18所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有vic荧光基团、3'末端修饰有bhq1淬灭基团；
27、和/或，具有如seq id no.21所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有texas red荧光基团、3'末端修饰有bhq2淬灭基团；
28、和/或，具有如seq id no.24所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有cy5荧光基团、3'末端修饰有mgb淬灭基团。
29、在本技术的第二方面，本技术提供了一种pcr扩增体系，所述pcr扩增体系包括如本技术第一方面所述的引物探针组合物。
30、在本技术的第三方面，本技术提供了如下任意项在制备用于检测猪病毒性腹泻病原体的产品中的用途：
31、(i)、本技术第一方面所述的引物探针组合物；
32、(ii)、本技术第二方面所述的pcr扩增体系。
33、在一些实施方式中，所述猪病毒性腹泻病原体包括猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪细小病毒、非洲猪瘟病毒、猪急性腹泻综合征病毒和产气荚膜梭菌。
34、在本技术的第四方面，本技术提供了一种检测猪病毒性腹泻病原体的检测试剂，所述检测试剂包括本技术第一方面所述的引物探针组合物；和/或，本技术第二方面所述的pcr扩增体系。
35、在本技术的第五方面，本技术提供了一种检测猪病毒性腹泻病原体的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括本技术第一方面所述的引物探针组合物；和/或，本技术第二方面所述的pcr扩增体系。
36、本技术具有以下有益效果：
37、第一、本技术中各引物对之间具有高度的特异性，避免出现非特异性的扩增产物，保证扩增出的目的片段的大小存在明显差异，避免所用引物间的相互作用从而避免引物二聚体的产生；由此，便于通过电泳或rt-pcr(reverse transcription pcr，反转录pcr)等其它检测方法鉴别样本中不同病原体。
38、第二、基于本技术引物探针组合物的八联rt-pcr检测技术，能够同时检测猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪细小病毒、非洲猪瘟病毒、猪急性腹泻综合征病毒和产气荚膜梭菌等共计八种猪病毒性腹泻病原体，且特异性良好，对样本核酸有特异性扩增，无非特异性反应。这大大地缩短了检测过程中物料的成本及检测人员的时间成本，尤其适用于大规模的样品检测和样品的混合感染检测。
39、第三、本技术能够同时检测八种猪病毒性腹泻病原体，不仅覆盖更多的猪病毒性腹泻病原体，而且大大节省了检测时间，对于可疑样本的筛选更加便捷。
1.一种检测猪病毒性腹泻病原体的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，每条所述探针的5'末端和3'末端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括fam荧光基团、vic荧光基团、texas red荧光基团、cy5荧光基团、fam荧光基团、rox荧光基团中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括bhq1淬灭基团、bhq2淬灭基团、mgb淬灭基团、tamra淬灭基团中的至少一种。
5.根据权利要求1至4任一项所述的引物探针组合物，其特征在于，具有如seq id no.3所示核苷酸序列的探针的5'末端修饰有fam荧光基团、3'末端修饰有bhq1淬灭基团；
6.一种pcr扩增体系，其特征在于，所述pcr扩增体系包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组合物。
7.如下任意项在制备用于检测猪病毒性腹泻病原体的产品中的用途：
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述猪病毒性腹泻病原体包括猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪细小病毒、非洲猪瘟病毒、猪急性腹泻综合征病毒和产气荚膜梭菌。
9.一种检测猪病毒性腹泻病原体的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组合物；和/或，如权利要求6所述的pcr扩增体系。
10.一种检测猪病毒性腹泻病原体的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组合物；和/或，如权利要求6所述的pcr扩增体系。
