本发明涉及农业生物，具体涉及一种突变的葡萄糖氧化酶gox-m12-t108s及其编码基因和应用。
背景技术：
1、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，gox）是一种需氧脱氢酶，ec号为1.1.3.4。它能够在有氧条件下高度专一的将β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，因此又称为β-d-葡萄糖氧化还原酶。目前市面上大多数的gox都是由备受关注的毕赤酵母真核表达系统中异源表达实现的。工业化生产gox的菌株主要来源于黑曲霉和青霉。相对而言，黑曲霉产的gox热稳定性较好，而青霉产的gox酶活较高。gox作为食品行业中一种重要的工业用酶，广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、食品褐变预防等方面，在医药行业中人体生化指标葡萄糖的定量测定以及饲料行业中为益生菌提供厌氧环境等方面也有大量的应用。
2、中国专利cn112301009a提供了来源于 aspergillus niger的葡萄糖氧化酶的gox突变体，其中突变体gox-m10的最适温度以及最适ph分别为45 ℃，ph 5.5。
3、在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先将葡萄糖氧化酶突变体goxm10进行四点突变，第241位氨基酸由gln突变为glu、第499位氨基酸由arg突变为glu、第361位氨基酸由glu突变为pro、第419位氨基酸由ala突变为ile，得到变体gox-m12，与突变母本goxm10相比，在不影响母本的酶活性和热稳定性的前提下有效改善了其酸稳定性。
4、为了满足特点行业对gox的应用需求，即获得具有酸稳定性好、活力高等特点的gox，目前的普遍手段是挖掘新颖的基因资源、蛋白质工程和优化应用环境等。利用蛋白质工程的手段对gox进行分子改良以提高其酸稳定性研究更是取得了快速发展。目前提高gox酸稳定性的原理尚不清晰，多与提升稳定性伴行。统计目前关于酶稳定性改良研究方面的报道论文，关于蛋白表面静电相互作用、b-factor值、疏水相互作用、氢键、盐键、阳离子-π相互作用、二硫键等理性设计策略被广泛应用在对蛋白质稳定性改良中。但是，以上提到的策略中，绝大多数都是以损失酶催化活力为代价来提高蛋白质酸稳定性的。因此，探究一种既能提高蛋白质酸稳定性，又不损失酶活的蛋白质改造策略是非常有意义的。本发明尝试在不损失酶活的前提下改良gox的热稳定性，具有重要的理论研究意义和应用意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种突变的葡萄糖氧化酶gox-m12-t108s，酶活力及酸稳定性较野生酶进一步提高。
2、本发明的再一目的是提供编码上述突变的葡萄糖氧化酶gox-m12-t108s的基因。
3、本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
4、本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
5、本发明的另一目的是提供一种制备葡萄糖氧化酶的方法。
6、根据本发明的突变的葡萄糖氧化酶gox-m12-t108s，其氨基酸序列如seq id no:1所示（对葡萄糖氧化酶gox-m12的108位氨基酸进行定点突变，即thr108ser）。
7、seq id no:1：
8、gieaslltdpkevagrtvdyiiagggltglvvaarltenpditvlviesgsyesdrgpiiedlnaygkifgssvdhayetvclatnnrtaliragnglggstlvnggswtrphkaqvdswetvfgnegwnwdsvaayslqaerarapnakqiaaghyfnaschgingtvhagprdtgddyspivkalmsavedrgvptkkdlgcgdphgvsmfpntlhedqvrsdaarewllpnyqrpnlevltgqyvgkvllsqnattpravgvefgthkgnfhnvtakhevllaagsavsptileysgigmksileplgiktvvdlpvglnlqdqttstvrsritsagagqgqaawfatfnetfgdytpkahellntkleqwaeeavarggfhnttalliqyenyrdwivkdnvayselfldtageisfdvwdllpftrgyvhildkdpylrhfaydpqyflneldllgqaaatqlarnisnsgamqtyfagetipgdnlaydadleawveyipyhfrpnyhgvgtcsmmpkemggvvdnaarvygvqglrvidgsipptqmsshvmtvfyamalkiadavladyasmq。
9、所述酶活力和热稳定性均提高的葡萄糖氧化酶突变体gox-m12-t108s编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
10、seq id no:2:
11、ggtattgaggcttccttgttgactgacccaaaggaggtcgccggtagaactgttgactacatcattgctggtggtggattgactggtttggttgtcgctgccagattgactgagaacccagacatcaccgttttggtcattgagtccggttcttacgaatctgatagaggtcctatcattgaagacttgaacgcttacggtaaaatcttcggatcttccgttgaccacgcttacgagactgtctgccttgccactaacaatagaaccgctttgattagagctggtaacggtttgggtggttctactttggttaacggaggttcttggaccagaccacacaaggctcaagttgactcttgggagaccgtcttcggtaacgaaggttggaattgggattctgtcgcagcttactccttgcaggccgagagagcccgtgctccaaacgctaagcaaatcgccgcaggtcactacttcaacgcctcctgtcacggtattaacggaactgttcacgctggtccaagagacaccggtgacgattactctcctatcgtcaaggccttgatgtccgctgttgaagacagaggtgtcccaactaagaaggacttgggttgcggagacccacatggtgtttctatgttccctaacaccttgcacgaggaccaagtcagatccgatgctgcccgtgaatggttgcttccaaactaccaaagacctaacttggaggttttgaccggtcaatacgttggtaaggtccttttgtctcaaaacgccactaccccaagagctgttggtgtcgagttcggaactcacaagggtaactttcacaatgttaccgctaaacacgaagtccttttggcagctggttccgctgtttctccaactatcttggagtactctggtatcggaatgaagtccattttggaaccacttggtattaagaccgtcgttgacttgcctgttggtctgaacttgcaagaccagactacctctactgtcagatcccgtattacctccgccggtgctggacagggtcaggctgcctggtttgctactttcaacgagaccttcggtgactacactccaaaggctcacgaattgcttaacaccaaattggaacaatgggctgaggaagccgttgctagaggtggtttccacaacactaccgctcttttgatccaatacgagaactacagagactggattgttaaggataacgtcgcttactctgaattgttcttggacactgccggtgagatttccttcgacgtctgggacttgctgccattcactagaggatacgttcacatcttggacaaggacccatacttgagacacttcgcttacgatcctcaatacttcttgaacgagttggacttgcttggtcaggctgccgctactcaattggctagaaacatctctaactccggtgccatgcaaacttactttgctggtgaaaccattccaggtgacaacttggcctacgatgctgacttggaggcttgggttgaatacattccataccacttcagacctaactaccatggtgtcggaacctgttctatgatgccaaaggagatgggtggtgtcgttgacaacgccgctagagtttacggtgtccagggattgagagttatcgacggttctatcccacctactcaaatgtcctctcacgttatgaccgtcttctacgctatggctttgaagatcgcagacgctgttttggctgactacgcctccatgcaa。
12、葡萄糖氧化酶gox-m12的氨基酸序列如seq id no:3所示。
13、seq id no:3：
14、gieaslltdpkevagrtvdyiiagggltglvvaarltenpditvlviesgsyesdrgpiiedlnaygkifgssvdhayetvclatnnrtaliragnglggstlvnggswtrphkaqvdswetvfgnegwnwdsvaayslqaerarapnakqiaaghyfnaschgingtvhagprdtgddyspivkalmsavedrgvptkkdlgcgdphgvsmfpntlhedqvrsdaarewllpnyqrpnlevltgqyvgkvllsqnattpravgvefgthkgnfhnvtakhevllaagsavsptileysgigmksileplgiktvvdlpvglnlqdqttstvrsritsagagqgqaawfatfnetfgdytpkahellntkleqwaeeavarggfhnttalliqyenyrdwivkdnvayselfldtageisfdvwdllpftrgyvhildkdpylrhfaydpqyflneldllgqaaatqlarnisnsgamqtyfagetipgdnlaydadleawveyipyhfrpnyhgvgtcsmmpkemggvvdnaarvygvqglrvidgsipptqmsshvmtvfyamalkiadavladyasmq。
15、根据本发明的制备酶活力和热稳定性均提高的葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：
16、1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
17、2）培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶表达；
18、3）回收并纯化所表达的突变酶。
19、本发明还提供了上述突变体的应用。
20、本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高酶活力与优酸稳定性的、适合于在食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的葡萄糖氧化酶。本发明的突变酶酶活力由485.68 u/mg提高到了521.75 u/mg，提高幅度为7.4%；在ph为3.0的柠檬酸-磷酸缓冲液（0.1 mm）中37℃下处理60 min后，gox-m12的剩余酶活为286.70 u/mg，gox-m12-t108s的剩余酶活为354.98 u/mg，酸稳定性提高幅度为17.9%。在ph为2.5的柠檬酸-磷酸缓冲液（0.1 mm）中37℃下处理30 min后，gox-m12的剩余酶活为37.46 u/mg，gox-m12-t108s的剩余酶活为130.46 u/mg，稳定性提高2.24倍。能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。
1.酶活力及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶gox-m12突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酶活力及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶gox-m12突变体。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
4.包括权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因的重组表达载体。
5.包括权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因的重组菌株。
6.权利要求1所述的酶活力及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶gox-m12突变体的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述酶活力及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶gox-m12突变体用于水解葡萄糖。
8.一种提高葡萄氧化酶的酶活力及酸稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.一种制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
