本发明涉及药品生物检测领域，尤其涉及一种同时检测左旋多巴、苄丝肼及2,3,4-三羟基苄肼血药浓度的方法。
背景技术：
1、帕金森病(parkinson’s disease，pd)是一种常见的中老年神经系统退行性疾病，主要以黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成的病理变化，纹状体区多巴胺递质降低、多巴胺与乙酰胆碱递质失平衡的生化改变，震颤、肌强直、动作迟缓、姿势平衡障碍的运动症状和睡眠障碍、嗅觉障碍、自主神经功能障碍、认知和精神障碍等非运动症状的临床表现为显著特征。
2、左旋多巴(levodopa，ld)类药物是治疗帕金森病最主要的药物，左旋多巴进入脑内后在多巴脱羧酶的作用下脱羧产生多巴胺(da)而发挥疗效。盐酸苄丝肼(benzhydrazinehydrochloride，bdh)为常见的多巴脱羧酶抑制剂，其与左旋多巴合用可以抑制多巴胺在外周中枢神经系统中的脱羧作用，大大减少左旋多巴用量，增加其脑内生物利用度，减少副作用。2,3,4-三羟基苄肼为苄丝肼的主要活性代谢产物。按照《化学药物制剂生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》的要求，进行试验药多巴丝肼(t)与参比药madopar(r)两制剂一致性评价时，需要对两制剂生物样品中的左旋多巴、苄丝肼和2,3,4-三羟基苄肼进行药代动力学研究以及生物等效性研究。目前尚无左旋多巴、苄丝肼和2,3,4-三羟基苄肼三种化合物联合检测的液质联用方法发表。
3、中国专利cn116908319a公开了一种检测血液中苄丝肼浓度的方法，中国专利cn116183783a公开了一种同时检测血液中6种药物浓度的方法，两种方法使用lc-ms/ms法分别测定血浆中苄丝肼和包含左旋多巴在内的6种药物浓度。为满足苄丝肼的生物样本稳定性的需求，在全血离心取得血浆后，立即按照体积比1:2加入甲醇，得到样本混合液。另外，为满足左旋多巴的生物样本稳定性的需求，在全血离心取得血浆后，立即按照体积比1:1加入稳定剂(6％高氯酸+10％焦亚硫酸钠)，得到样本混合液。两种稳定剂的添加，使得血浆样品常温可保存24小时，4℃可保存48小时。该稳定性时长无法满足如生物利用度实验和生物等效性实验中大批量样本的储存要求。由于这两种技术选用的稳定剂、梯度洗脱的梯度设计均不同，因此任何一种方法都无法满足同时检测左旋多巴和苄丝肼的要求。由于苄丝肼在体内代谢较快，对于等效性评价的指导意义不及代谢产物2,3,4-三羟基苄肼，所以开发一种能同时满足左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼稳定性要求，并能在同一方法下，完成三种成分检测的液质联用方法是很有必要的。
4、现有技术(j.chromatogr.b 967(2014)41–49)使用液相色谱-串联质谱法(lc-ms)测定血浆中左旋多巴、卡比多巴和其代谢产物3-o-甲基多巴、多巴胺的浓度。对于待测物左旋多巴的定量下限为75.0ng/ml，使用400μl血浆样品进行前处理，用血需求量大；沉淀离心后通过过滤器过滤得到上清溶液进样分析，容易造成污染，酸性样品对色谱柱的损伤较大；分析时长为10分钟，分析时间长，影响实验的效率。
5、由于临床药代动力学检测时样本量大，因此寻求一种能同时满足左旋多巴、苄丝肼与2,3,4-三羟基苄肼的联合检测方法，且方法稳定、快速、灵敏，对于多巴丝肼片临床生物等效性研究具有重要意义。
技术实现思路
1、为了解决现有技术无法满足多巴丝肼片制剂一致性评价的生物等效性研究要求，无法同时检测左旋多巴、苄丝肼及2,3,4-三羟基苄肼的血药浓度的问题，本发明提供一种检测限低、灵敏度高；前处理样本所需血浆样本少、便于临床多周期多采样点采血；前处理方式更快捷高效、检测时间更短、更适合高通量检测，且可同时检测血液中左旋多巴、苄丝肼及2,3,4-三羟基苄肼浓度的液质联用方法；
2、本发明提供的液质联用方法采用如下的技术方案:
3、一种同时检测左旋多巴、苄丝肼及2,3,4-三羟基苄肼血药浓度的方法，包括以下步骤：
4、a.标准曲线和质控样品配制：
5、配制左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼标准曲线工作液和质控样品工作液，将左旋多巴、苄丝肼和2,3,4-三羟基苄肼工作液等体积混合，配制三种待测物的混合标准曲线样品及质控样品的工作溶液；
6、将三种待测物的混合标准曲线样品及质控样品的工作溶液中加入空白血浆，混合均匀，制得具有浓度梯度的左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼标准曲线样品及质控样品。
7、b.待测样品前处理
8、(1)将以氟化钠-肝素钠为抗凝剂的血浆样品置于湿冰黄光下，加入5％体积的稳定剂，混匀备用；
9、(2)吸取50μl血浆样品于96孔板中，加入20μl内标工作液和500μl乙腈于96孔板中；
10、(3)涡旋1min，在温度为4℃，转速为3700rpm条件下离心15min；取上清液400μl于上样套管中；
11、(4)不加热条件下，氮气吹干，备用。
12、c.lc-ms/ms测定
13、取步骤b中所得样品，加入5％甲酸水溶液100μl进行复溶，涡旋1min，放到自动进样器进样分析。
14、优选的，标准曲线和质控样品工作液的配制步骤为：在湿冰黄光条件下，用50％甲醇水溶液分别序列稀释待测物左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼的储备液，配制标准曲线样品及质控样品的工作溶液。
15、优选的，左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼标准曲线样品的浓度范围分别为15-5400ng/ml、0.5-30ng/ml、0.2-60ng/ml。
16、优选的，左旋多巴标准曲线样品的浓度分别为15ng/ml、30ng/ml、90ng/ml、240ng/ml、600ng/ml、2100ng/ml、4300ng/ml、5400ng/ml；苄丝肼标准曲线样品的浓度分别为0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、12ng/ml、24ng/ml、30ng/ml；2,3,4-三羟基苄肼标准曲线浓度分别为0.2ng/ml、0.4ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、48ng/ml、60ng/ml。
17、优选的，内标工作液的配制步骤为：在湿冰黄光条件下，用50％甲醇水溶液将内标储备液稀释制得内标工作液。
18、优选的，左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼的内标物分别为左旋多巴-d3、苄丝肼-d3和2,3,4-三羟基苄肼-15n2，内标工作液的浓度分别为4000ng/ml、40ng/ml、20ng/ml。
19、优选的，储备液的配制步骤为：称取一定量左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼对照品，置于玻璃瓶中，加入适量dmso溶解，即得待测物储备液；称取左旋多巴-d3、苄丝肼-d3和2,3,4-三羟基苄肼-15n2对照品，置于玻璃瓶中，加入适量dmso溶解，即得内标储备液。
20、优选的，待测物储备液的浓度为1mg/ml，内标储备液的浓度为0.1mg/ml。
21、优选的，步骤a中所述稳定剂为5％甲酸水溶液。
22、优选的，所述lc-ms/ms检测方法中高效液相色谱条件为：
23、色谱柱：waters acquity uplc beh c18,1.8μm,2.1×100mm；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；流动相a：10mm甲酸铵-0.2％甲酸溶液；流动相b：乙腈-0.2％甲酸溶液；进样量：10μl；进行梯度洗脱。
24、优选的，梯度洗脱程序设置为：
25、
26、
27、优选的，质谱色谱条件为：
28、离子源类型为：esi源；
29、电离方式为：正离子；
30、检测模式：多反应监测；质谱参数如下表所示：
31、
32、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
33、本发明能够同时检测多巴丝肼片中的主要成分左旋多巴、苄丝肼和代谢产物2,3,4-三羟基苄肼的血药浓度，相较于单独检测，节约了检测时间和检测用血量。
34、本发明通过以氟化钠-肝素钠为抗凝剂的采血管，相较于传统edtak2作为抗凝剂，使得样品中的苄丝肼的稳定性更好。
35、本发明通过使用5％甲酸水溶液作为稳定剂加入到临床采血的血浆样品中，相较于分别加甲醇或6％高氯酸+10％焦亚硫酸钠两种稳定剂来说，操作更简便，用血量更少。
36、本发明通过使用蛋白沉淀法，离心取上清后吹干复溶进样，相比现有技术方案中通过pvdf过滤器过滤，无需过滤步骤，方法简便易行。
37、本发明左旋多巴、苄丝肼和2,3,4-三羟基苄肼定量下限分别为15ng/ml、0.5ng/ml和0.2ng/ml，灵敏度相较于现有技术更高，本发明定量下限能更好的满足国内生物等效性实验药代动力学数据的cmax的1/10-1/20的要求。
1.一种同时检测左旋多巴、苄丝肼及2,3,4-三羟基苄肼血药浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线和质控样品工作液的配制步骤为：在湿冰黄光条件下，用50％甲醇水溶液分别序列稀释待测物左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼的储备液，配制标准曲线样品及质控样品的工作溶液。
3.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼标准曲线样品的浓度范围分别为15-5400ng/ml、0.5-30ng/ml、0.2-60ng/ml。
4.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，内标工作液的配制步骤为：在湿冰黄光条件下，用50％甲醇水溶液将内标储备液稀释制得内标工作液。
5.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼的内标物分别为左旋多巴-d3、苄丝肼-d3和2,3,4-三羟基苄肼-15n2，内标工作液的浓度分别为4000ng/ml、40ng/ml、20ng/ml。
6.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，储备液的配制步骤为：称取一定量左旋多巴、苄丝肼、2,3,4-三羟基苄肼对照品，置于玻璃瓶中，加入适量dmso溶解，即得待测物储备液；称取左旋多巴-d3、苄丝肼-d3和2,3,4-三羟基苄肼-15n2对照品，置于玻璃瓶中，加入适量dmso溶解，即得内标储备液。
7.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测物储备液的浓度为1mg/ml，内标储备液的浓度为0.1mg/ml。
8.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述稳定剂为5％甲酸水溶液。
9.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms检测方法中高效液相色谱条件为：
10.按照权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤c中质谱条件为：
