本发明属于活性肽制备领域，涉及一种新型卵白蛋白增肌肽及其制备方法和应用。
背景技术：
1、近年来随着人们生活节奏逐渐加快、生活及饮食习惯不良，个体营养缺乏、代谢紊乱及体重失衡等不良现象已逐渐成为国民关注的热点问题。相关研究表明，营养缺乏会引发肌肉减少、骨质疏松、免疫力降低等众多疾病。肌肉损失会使机体力量降低，肌耐力和代谢能力下降以及结缔组织和脂肪增多等。膳食蛋白质作为一类生物大分子，是构成机体组织或器官的重要成分，补充蛋白质可增加肌肉蛋白质合成并改善净蛋白质平衡，从而改善肌肉质量，但目前对膳食蛋白质增肌的研究多聚焦于乳清蛋白和胶原蛋白，而对其他膳食蛋白质的研究有待进一步挖掘。
2、鸡蛋清蛋白作为优质的蛋白资源，其蛋白模式与人体蛋白模式最为相似， 被认为是最适合人类的天然蛋白质来源之一。卵白蛋白（ovalbumin, ova）作为鸡蛋清中含量最多的蛋白质，可提供人体需要的所有必需氨基酸，是一种优质的蛋白质来源，具有促进机体组织发育、免疫调节等生物活性。目前卵白蛋白的生理功能和生物活性受到了广泛的研究和应用，主要集中在免疫调节、抗炎、降低血压等方面，但是对卵白蛋白增肌的研究鲜有报道。
3、现代营养学研究发现，人体摄取蛋白质后主要经胃肠消化作用将蛋白质酶解为小分子肽或氨基酸形式吸收，这类小分子物质具有不同的生理功能，可参与调节人体免疫系统、内分泌系统、心血管系统和神经系统，并影响机体对以营养素的利用。然而，在围绕卵白蛋白增肌关键物质的确定、制备、纯化和鉴定方面存在诸多尚未被解决的问题，严重阻碍卵白蛋白增肌的产业化应用。
技术实现思路
1、本发明提出了一种新型卵白蛋白增肌肽及其制备方法。
2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：
3、一种新型卵白蛋白增肌肽，所述卵白蛋白多肽包括多肽1、多肽2、多肽3、多肽4、多肽5或其组合，多肽1为seq id no.1所示的氨基酸序列（adhpflf）；多肽2为seq id no.2所示的氨基酸序列（cplsilt）；多肽3为seq id no.3所示的氨基酸序列（sfslasrl）；多肽4为seq id no.4所示的氨基酸序列（srpilpiylk）；多肽5为seq id no.5所示的氨基酸序列（yqiglfr）。
4、优选地，所述方法为：卵白蛋白增肌肽经过体外模拟消化后经提取、分离纯化得到。
5、进一步优选地，所述体外模拟消化的具体方法为：将卵白蛋白加入胃蛋白酶酶解，之后调节ph=7，加入胰蛋白酶酶解，然后沸水浴灭活蛋白酶，收集样品离心，收集上清液得到卵白蛋白酶解液。
6、进一步优选地，所述体外模拟消化的具体方法为：将浓度为1-2 mg/ml的卵白蛋白加入胃蛋白酶（酶与底物比为1:50），保持ph=2-3，37℃，酶解90-120 min，之后调节ph=7，加入胰蛋白酶（酶与底物比为1:25），保持ph=7-8，37℃，酶解180-240 min，整个酶解过程中持续搅拌，然后沸水浴5-10 min灭活蛋白酶，收集样品于4℃下 8000-10000 r/min离心10-15min，收集上清液得到卵白蛋白酶解液。
7、更进一步优选地，所述体外模拟消化提取的具体方法为：将浓度为2 mg/ml的蛋白加入胃蛋白酶（酶与底物比为1:50），保持ph=2，37℃，酶解90-120 min，之后调节ph=7，加入胰蛋白酶（酶与底物比为1:25），保持ph=7，37℃，酶解180-240 min，整个酶解过程中持续搅拌，然后沸水浴10 min灭活蛋白酶，收集样品于4℃下 10000 r/min离心10min，收集上清液冻干，用于后续检测分析。
8、优选地，所述分离纯化具体包括以下步骤：
9、（1）卵白蛋白多肽提取物的超滤分离：依次选择截留分子量为10 kda和3 kda的超滤管对卵白蛋白酶解液进行分级分离，得到3个组分op-1（<3 kda）、op-2（3-10 kda）和op-3（>10 kda），测定各组分的对c2c12细胞的细胞活力的影响；
10、（2）卵白蛋白多肽提取物凝胶过滤层析分离：使用g-25 凝胶过滤柱进行分离洗脱得到洗脱成分，洗脱成分真空冷冻干燥；
11、（3）卵白蛋白多肽反相液相色谱分离纯化：对步骤（2）得到的组分进一步分离，冻干后溶于超纯水中，采用反相色谱柱进行梯度洗脱，获得新型卵白蛋白增肌肽。
12、进一步优选地，所述步骤（2）中：g-25 凝胶过滤柱分离洗脱条件为：洗脱液为超纯水，流速为0.8-1.0 ml/分钟；所述步骤（3）梯度洗脱：流速1.0-1.2 ml/min，流动相a为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流动相b为0.1%乙腈溶液；流动梯度为：0-20 min，100%a，20-40 min，0-50% b；40-50 min，50% a；
13、更进一步优选地， g-25 凝胶过滤柱分离洗脱条件为：洗脱液为超纯水，流速为0.8 ml/分钟；所述步骤（3）梯度洗脱：流速1.0 ml/min，流动相a为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流动相b为0.1%乙腈溶液；流动梯度为：0-20 min，100%a，20-40 min，0-50% b；40 min，50%a。
14、一种新型卵白蛋白增肌肽的鉴定筛选方法，所述新型卵白蛋白增肌肽或所述制备方法得到的新型卵白蛋白增肌肽进行筛选，所述筛选鉴定方法为采用液相色谱串联质谱对分离纯化得到的新型卵白蛋白增肌肽进行筛选分析，鉴定活性肽的结构。
15、优选地，所述鉴定筛选方法具体步骤包括：
16、a：采用easy-nlc高效液相色谱系统，使用rplc c18色谱柱对促进c2c12细胞的细胞活力的多肽组分进行分离；梯度洗脱：流动相a：0.1%甲酸；流动相b：0.1%甲酸，80% 乙腈；流速：600 nl/min；流动梯度为：0-20 min，100%a，20-40min，0-50% b；40 min，50% a；前体离子记录的质量范围为m/z=300-4000；使用byonic检索目标蛋白数据库，分析质谱图信息，分别筛选出包括多肽1、多肽2、多肽3、多肽4和多肽5；
17、b：筛选：采用计算机模拟技术对最具增肌活性的五条多肽进行虚拟筛选，综合虚拟筛选结果对最具增肌活性的五条多肽的功能活性进行分析；
18、进一步优选地，所述一种新型卵白蛋白增肌肽的筛选方法， 所述步骤b中，虚拟筛选方法为：使用autodock软件研究多肽与fgfr1结合能的大小、氢键和分子间作用力；使用gromacs软件，通过charmm36力场对肽-fgfr1复合物进行分子动力学模拟，分子动力学仿真条件如下：使用最速下降算法进行能量最小化，并持续直到最大力<600.0 kj/mol/nm，步长为0.001；使用蛙跳算法进行1 ns的模拟，步长为2 fs，温度和压力分别设置为200 k和1bar，模拟时间50 ns，计算出均方根偏差、氢键数量、回转半径、表面溶剂可及面积来分析肽-fgfr1复合物的稳定性；使用gaussian 09进行密度泛函理论计算，使用半经验am1方法进行构型优化，并在在gaussian 09程序中，使用b3lyp/6-31获得几何形状来分析活性位点，计算多肽的能量指数和结构指数进行了计算。
19、所述新型增肌肽或所述制备方法或所述筛选方法得到的新型卵白蛋白增肌肽在抗氧化的保健品、药品、食品中的应用。
20、本发明的有益效果：
21、1、本发明的卵白蛋白源的增肌肽具有潜在的促肌肉修复价值，可促进禽蛋行业的精深加工和高值化应用。
22、2、本发明分析出了鸡蛋卵白蛋白中发挥增肌作用的关键物质组成（肽段序列）。
1.一种新型卵白蛋白增肌肽，其特征在于，所述卵白蛋白多肽包括多肽1、多肽2、多肽3、多肽4、多肽5或其组合，多肽1为seq id no.1所示的氨基酸序列；多肽2为seq id no.2所示的氨基酸序列；多肽3为seq id no.3所示的氨基酸序列；多肽4为seq id no.4所示的氨基酸序列；多肽5为seq id no.5所示的氨基酸序列。
2.一种新型卵白蛋白增肌肽的制备方法，其特征在于，所述方法为：卵白蛋白增肌肽经过体外模拟消化后经提取、分离纯化得到。
3.根据权利要求2所述新型卵白蛋白增肌肽的制备方法，其特征在于，所述体外模拟消化的具体方法为：将卵白蛋白加入胃蛋白酶酶解，之后调节ph=7，加入胰蛋白酶酶解，然后沸水浴灭活蛋白酶，收集样品离心，收集上清液得到卵白蛋白酶解液。
4.根据权利要求3所述新型卵白蛋白增肌肽的制备方法，其特征在于，所述体外模拟消化的具体方法为：将浓度为1-2 mg/ml的卵白蛋白加入胃蛋白酶，保持ph=2-3，37°c，酶解90-120 min，之后调节ph=7，加入胰蛋白酶，酶与底物比为1:25，保持ph=7-8，37°c，酶解180-240 min，整个酶解过程中持续搅拌，然后沸水浴5-10 min灭活蛋白酶，收集样品于4°c下 8000-10000 r/min离心10-15 min，收集上清液得到卵白蛋白酶解液；
5.根据权利要求2所述新型卵白蛋白增肌肽制备方法，其特征在于，所述分离纯化具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述新型卵白蛋白增肌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中：g-25 凝胶过滤柱分离洗脱条件为：洗脱液为超纯水，流速为0.8-1.0 ml/分钟；所述步骤（3）梯度洗脱：流速1.0-1.2 ml/min，流动相a为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流动相b为0.1%乙腈溶液；流动梯度为：0-20 min，100%a，20-40 min，0-50% b；40-50 min，50% a；
7.一种新型卵白蛋白增肌肽的鉴定筛选方法，其特征在于，对权利要求1-2任意一项所述新型卵白蛋白增肌肽或权利要求3-6任意一项所述制备方法得到的新型卵白蛋白增肌肽进行筛选，所述筛选鉴定方法为采用液相色谱串联质谱对分离纯化得到的新型卵白蛋白增肌肽进行筛选分析，鉴定活性肽的结构。
8.根据权利要求7所述一种新型卵白蛋白增肌肽的筛选方法，其特征在于，所述鉴定筛选方法具体步骤包括：
9.根据权利要求8所述一种新型卵白蛋白增肌肽的筛选方法，其特征在于，所述步骤b中，虚拟筛选方法为：使用autodock软件研究多肽与fgfr1结合能的大小、氢键和分子间作用力；使用gromacs软件，通过charmm36力场对肽-fgfr1复合物进行分子动力学模拟，分子动力学仿真条件如下：使用最速下降算法进行能量最小化，并持续直到最大力<600.0 kj/mol/nm，步长为0.001；使用蛙跳算法进行1 ns的模拟，步长为2 fs，温度和压力分别设置为200 k和1 bar，模拟时间50 ns，计算出均方根偏差、氢键数量、回转半径、表面溶剂可及面积来分析肽-fgfr1复合物的稳定性；使用gaussian 09进行密度泛函理论计算，使用半经验am1方法进行构型优化，并在在gaussian 09程序中，使用b3lyp/6-31获得几何形状来分析活性位点，计算多肽的能量指数和结构指数进行了计算。
10.权利要求1所述新型增肌肽或权利要求2-6任意所述制备方法或权利要求7-9任意所述筛选方法得到的新型卵白蛋白增肌肽在抗氧化的保健品、药品、食品中的应用。
