本发明属于检测，具体涉及一种nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法。
背景技术：
1、细菌耐药性问题日益严重，削弱了传统抗生素的疗效，导致治疗成本上升和恢复期延长。全球多药耐药(mdr)细菌感染的激增对公共卫生构成严重威胁，促使研究人员寻求创新抗菌策略。其中，金纳米材料(aunps)因其独特的理化性能受到关注，表现出制备高效、抗菌性能好、生物安全性高、不易诱导耐药性等优势。前期一系列创新性研究工作初步证实，抗菌aunps会破坏细胞壁结构、干扰细菌代谢、并且抑制细菌的增殖。但是，抗菌aunps与细菌的动态相互作用以及抗菌机制仍然有很多不清楚的地方，有待深入探究。传统显微镜虽能观察aunps在细菌表面的吸附、聚集和细菌形貌变化，但受限于观察状态单一、分辨率有限和样品前处理复杂的影响，难以得到准确的抗菌机制。因此，迫切需要开发新方法以深入探究金纳米材料的抗菌机制。
2、中性解吸电喷雾萃取电离质谱(nd-eesi-ms)分析技术，结合电喷雾萃取电离和质谱分析，可以实现分子水平监测物质变化。无需复杂前处理，即可提供高灵敏度和高分辨率的分析结果，适用于定量分析。国内外学者利用电喷雾萃取电离质谱技术在复杂样品的检测方面做了一些探索。在食品安全领域，中国专利(专利公开号：cn104897767a)公开了中性解吸-电喷雾萃取电离质谱法快速检测蜂蜜中毒死蜱，中国专利(专利公开号：cn103822964a)公开了中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接检测蜂蜜中的氯霉素，中国专利(专利公开号：cn105445360a)公开了中性解吸电喷雾萃取电离质谱法快速检测蜂蜜中的敌敌畏，上述发明无需对待测样品进行预处理，实现对蜂蜜中毒害成分的快速检测和鉴定，改善现有分析技术操作步骤复杂、费时等缺陷。在生命科学领域，中国专利(专利公开号：cn111122691a)公开了一种采用nd-eesi-ms方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法，对盐胁迫下拟南芥叶进行原位活体无损分析，快速获取盐胁迫下叶中组份的变化信息，检测盐胁迫下拟南芥代谢产物。同时，中国专利(专利公开号：cn112198214a)公开了电喷雾萃取电离质谱检测系统，快速检测呼出气体中的成分，结合人工智能手段和算法判定患病情况。上述专利解决了检测操作复杂、检测时间长、检测成本较高的技术问题。但是，电喷雾萃取电离质谱技术在纳米抗菌领域鲜有应用，在无需复杂样品前处理的情况下，用于纳米材料与细菌之间的相互作用机制的研究并无报道。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法。
2、本发明提供的一种nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，包括以下步骤：
3、s1、制备抗菌金纳米颗粒，并测定所述抗菌金纳米颗粒对待测细菌的最低抑菌浓度；
4、s2、制备待测细菌菌液；
5、s3、向待测细菌菌液中加入所述抗菌金纳米颗粒，培养3-4h，离心收集上清液，得到待测样品，菌液中所述抗菌金纳米颗粒的浓度≥所述最低抑菌浓度；将未经抗菌金纳米颗粒处理的待测细菌菌液离心，收集上清液，得到对照样品；对所述待测样品和对照样品进行中性解吸电喷雾萃取电离质谱检测；
6、s4、中性解吸电喷雾萃取电离质谱检测：
7、设置中性解吸电喷雾萃取电离质谱的离子源为正离子模式，各个参数如下：离子源以甲醇为萃取剂，萃取剂通过石英毛细管，使用n2作为喷雾气流；在进样针的钢针部位施加2-5kv正高压，在电场的作用下，样品前端产生承载待测物的带电液滴，带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测；碰撞诱导解离cid实验时，母离子隔离宽度为1.6-2.0da，碰撞能量为20％-40％，其他条件为系统自动优化；
8、s5、定量分析待测样品相对于对照样品中的差异代谢物，通过向含所述抗菌金纳米颗粒的待测细菌菌液中补充所述差异代谢物，验证所述差异代谢物是否为所述抗菌金纳米颗粒的关键抗菌靶标。
9、进一步地，所述抗菌金纳米颗粒为对氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒，其制备方法如下：
10、用水将对氨基苯硼酸、三水氯金酸、三乙胺和吐温80溶解并混合均匀后得混合液；
11、再用水将硼氢化钠溶解后得硼氢化钠溶液；然后将硼氢化钠溶液逐滴添加至混合液中，搅拌，待瓶中的溶液颜色变成棕色时，在冰水浴中反应2-2.5h，获得所述抗菌金纳米颗粒。
12、更进一步地，所述去离子水、对氨基苯硼酸、三水氯金酸、三乙胺和吐温80的质量体积比为8-12ml：6-8mg：18-20mg：45-55μl：26-32mg。
13、更进一步地，所述去离子水和硼氢化钠的质量体积比为1-3ml：5-9mg。
14、更进一步地，所述待测细菌包括耐药肺炎克雷伯杆菌、肺炎克雷伯杆菌。
15、更进一步地，所述差异代谢物包括腺嘌呤、丝氨酸、高丝氨酸、异亮氨酸、腐胺、γ-氨基丁酸、精氨酸、亚精胺、蛋氨酸和精胺中的一种或多种。
16、进一步地，萃取剂的流速为9-12μl/min。
17、进一步地，喷雾气压为0.5-0.6mpa。
18、进一步地，石英毛细管温度为190-210℃。
19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20、(1)本发明通过将抗菌金纳米颗粒引入细菌中，与细菌相互作用，得出细菌的差异代谢物，再利用中性解吸电喷雾萃取电离质谱(nd-eesi-ms)分析技术对细菌的差异代谢物进行灵敏检测；在无需复杂样品前处理的情况下，通过检测细菌的差异代谢物(生物标志物)来判断抗菌金纳米颗粒是否具有抗菌活性，从而确定差异代谢物是否为抗菌金纳米颗粒的关键抗菌靶标，为细菌感染的临床诊断和公共卫生医疗提供了一种新的有效工具。
21、(2)本发明利用中性解吸电喷雾萃取电离质谱(nd-eesi-ms)分析技术可以实现分子水平监测物质动态变化，为纳米材料与细菌之间的相互作用机制研究提供理论和技术支撑。
1.一种nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒为对氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒，其制备方法如下：
3.根据权利要求2所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，所述去离子水、对氨基苯硼酸、三水氯金酸、三乙胺和吐温80的质量体积比为8-12ml：6-8mg：18-20mg：45-55μl：26-32mg。
4.根据权利要求3所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，所述去离子水和硼氢化钠的质量体积比为1-3ml：5-9mg。
5.根据权利要求4所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，所述待测细菌包括耐药肺炎克雷伯杆菌、肺炎克雷伯杆菌。
6.根据权利要求5所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，所述差异代谢物包括腺嘌呤、丝氨酸、高丝氨酸、异亮氨酸、腐胺、γ-氨基丁酸、精氨酸、亚精胺、蛋氨酸和精胺中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，萃取剂的流速为9-12μl/min。
8.根据权利要求1所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，喷雾气压为0.5-0.6mpa。
9.根据权利要求1所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，石英毛细管温度为190-210℃。
10.根据权利要求1所述的nd-eesi-ms实时检测抗菌金纳米颗粒与细菌相互作用的方法，其特征在于，质谱仪的扫描范围为m/z 50-1000。
