本发明属于分子生物检测，具体涉及一种快速区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法及配套试剂。
背景技术：
1、锈赤扁谷盗cryptolestes ferrugineus(stephens)和长角扁谷盗cryptolestespusillus oliver隶属于鞘翅目(coleoptera)、扁谷盗科(laemophloeidae)、扁谷盗属(cryptolestes)，是两种重要的后期性储粮害虫，多发生于初期害虫之后，取食多种农产品，在油料、木薯、坚果、干果、干菜，甚至甘草杏上也有发现，形态上极为相似，很难区分。
2、目前，常用的鉴定昆虫的方法以传统的形态学鉴定为主。然而，不同昆虫种类之间的形态学差别非常细微和复杂，鉴定需要严格的专业知识和系统性培训，且很难对未成熟虫态(卵、幼虫及蛹)、残损样品以及形态相似的种类进行快速鉴定。最常见的区分这两种扁谷盗的方法，包括观察锈赤扁谷盗和长角扁谷盗成虫前胸背板的形状和触角，锈赤扁谷盗前胸背板两侧缘向基部方向显著收缩，触角3节，第一节宽短，第二、三节略等长，并且长过第一节的2倍，长角扁谷盗前胸背板近长方形，端缘稍长于后缘。但是该方法耗时长、误判率高，且很难对批量样本进行快速鉴定。而分子生物学技术可以弥补传统分类学的不足，用于区分和鉴别近缘种。
3、不同于传统的pcr扩增，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，rpa)是近年来发展起来的一种病原快速检测技术，已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等的鉴定。rpa利用重组酶与引物形成复合物，促进引物与双链dna的同源靶序列结合，之后聚合酶进行延伸扩增，整个过程仅需要在37-42℃下反应20-30分钟即可，检测速度非常快。与传统pcr相比，rpa不需要高温变性和低温退火步骤，扩增流程简化，耗时较短，特别适用于体外检测、兽医、食品安全和生物安全检测等领域。
4、目前，rpa技术已经广泛应用于多种昆虫、寄生虫的快速检测。例如，中国专利cn113755620b(江苏省血液中心)公开的一种快速检测两种利什曼原虫的方法，以利什曼原虫高度保守序列作为检测目的基因，设计合成引物和探针序列，利用rpa反应体系(包含重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp等)快速鉴定利什曼原虫，灵敏度高，特异性好。但是，rpa技术尚未用于扁谷盗的鉴定检测。中国专利cn103952463b(中国农业大学)提供了一种基于特异引物鉴定5种常见储粮扁谷盗的方法，先对5种扁谷盗(锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗)的mtdnacoi序列进行dnaman比对分析，设计5对特异性扩增引物，利用传统pcr扩增进行鉴定。但是，该方法相较rpa扩增流程复杂、耗时长，且对检测设备要求较高(需要配置升降温模块)，不适用于poct检测。
5、因此，亟需开发一种利用rpa区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法和试剂。
技术实现思路
1、本发明主要解决的技术问题是提供一种快速区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法及配套试剂，可用于poct检测。
2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
3、一种区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的试剂，包括锈赤扁谷盗特异性检测引物、rpa反应缓冲液；
4、所述锈赤扁谷盗特异性检测引物根据seq id no：3所示核苷酸序列设计合成。
5、作为本发明一种优选的实施方案，所述锈赤扁谷盗特异性检测引物的核苷酸序列如下所示：
6、上游引物：5’-aatagcaggaacttctttaagtctcttaattc-3’(seq id no：1)；
7、下游引物：5’-tcttattaatagtaaagaaagtgatgggggaag-3’(seq id no：2)。
8、作为本发明一种优选的实施方案，所述rpa反应缓冲液包括但不限于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp、肌酸激酶、磷酸肌酸、dtt、dntp、醋酸镁等中的一种或多种。rpa反应缓冲液也可采用市售商品，如twist dx公司提供的basic试剂，包括rpa冻干反应微球(包含重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp等)、无引物再水合缓冲液和醋酸镁(用于引发反应)。
9、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还包括分子级水，用于定容反应体系。
10、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还包括阳性对照、阴性对照中的一种或两种。
11、一种区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法，包括以下步骤：
12、以待测样本的dna为模板，与锈赤扁谷盗特异性检测引物、rpa反应缓冲液混合，进行rpa扩增；
13、所述锈赤扁谷盗特异性检测引物根据seq id no：3所示核苷酸序列设计合成；
14、扩增反应完毕，对扩增产物进行分析，判定待测样本中是否存在锈赤扁谷盗，判定标准为：若扩增产物中出现锈赤扁谷盗的目的片段，则判定待测样本中存在锈赤扁谷盗；反之，则判定待测样本中不存在锈赤扁谷盗。
15、作为本发明一种优选的实施方案，所述锈赤扁谷盗特异性检测引物的核苷酸序列如下所示：
16、上游引物：5’-aatagcaggaacttctttaagtctcttaattc-3’；
17、下游引物：5’-tcttattaatagtaaagaaagtgatgggggaag-3’。
18、作为本发明一种优选的实施方案，所述rpa反应缓冲液包括但不限于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp、肌酸激酶、磷酸肌酸、dtt、dntp、醋酸镁等中的一种或多种。
19、具体的，所述rpa反应缓冲液采用twist dx公司提供的basic试剂，包括rpa冻干反应微球、无引物再水合缓冲液和醋酸镁。
20、作为本发明一种优选的实施方案，所述模板与锈赤扁谷盗特异性检测引物、rpa反应缓冲液、分子级水混合，进行rpa扩增。
21、具体的，所述rpa扩增的反应体系为：锈赤扁谷盗特异性检测引物2.8μl(10μm上、下游引物各1.4μl)，反应缓冲液(可由basic试剂中rpa冻干反应微球和无引物再水合缓冲液配制得到)29.4μl，ddh2o 10.3μl，模板(dna浓度不低于0.1ng/μl)5μl，280mm醋酸镁2.5μl，总体积50μl。
22、具体的，所述rpa扩增的反应程序为：37-42℃下恒温反应15-30min。
23、作为本发明一种优选的实施方案，所述扩增产物(纯化后)进行凝胶电泳分析，若泳道中出现锈赤扁谷盗的特异性条带，则判定待测样本中存在锈赤扁谷盗；反之，则判定待测样本中不存在锈赤扁谷盗。例如，当采用seq id no：1-2所示上、下游引物进行rpa扩增时，特异性条带大小应在265bp左右，对应seq id no：3所示核苷酸序列。
24、本发明的有益效果：
25、本发明提供的快速区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法具有以下优点：
26、(1)节约时间：rpa整个检测过程至多30min，远低于传统pcr的1.5h；
27、(2)反应温度降低：恒温40℃左右即可完成检测，远低于传统pcr的60-95℃；
28、(3)试剂储存方便，操作简单：rpa扩增所需的酶和其他必要组分能冻干后常温储存，扩增时只需要加入无引物再水合缓冲液、引物和模板，并加入镁离子激活反应，对操作人员和设备要求低，适用于现场快速检测；
29、(4)特异性好，对长角扁谷盗不产生特异性扩增条带；
30、(5)灵敏度高，模板浓度大于10-1ng/μl时，均能发生特异性扩增。
31、本发明还提供一种快速区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的试剂，组成简单，可常温运输和储存，具有良好的应用前景。
1.一种区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的试剂，其特征在于：所述试剂包括锈赤扁谷盗特异性检测引物、rpa反应缓冲液；
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述锈赤扁谷盗特异性检测引物的核苷酸序列如下所示：
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述rpa反应缓冲液包括但不限于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp、肌酸激酶、磷酸肌酸、dtt、dntp、醋酸镁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括分子级水。
5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括阳性对照、阴性对照中的一种或两种。
6.一种区分锈赤扁谷盗和长角扁谷盗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述锈赤扁谷盗特异性检测引物的核苷酸序列如下所示：
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述rpa反应缓冲液包括但不限于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、atp、肌酸激酶、磷酸肌酸、dtt、dntp、醋酸镁中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述rpa扩增的反应体系为：10μm上、下游引物各1.4μl，反应缓冲液29.4μl，ddh2o 10.3μl，模板5μl，280mm醋酸镁2.5μl，总体积50μl。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述rpa扩增的反应程序为：37-42℃下恒温反应15-30min。
