本发明属于医药生物，具体涉及具有抗细胞因子风暴活性的依博多糖及其制备方法。
背景技术：
1、链霉菌139(streptomyces sp 139)是胞外多糖依博素的产生菌，2019年完成了链霉菌139(streptomyces sp 139)的全测序工作(ai l，geng m，ma m，bai l*.completegenome sequence ofthe ebosin-producing strain streptomyces sp.139.microbiolresour announc.2019，8(49).pii:e01283-19.)。为进一步提高依博素的产量，研究者运用同源重组技术敲除链霉菌139(streptomyces sp 139)中的ste2基因，获得ste2基因阻断株，将其命名为streptomycessp 139d2(记载于中国发明专利文献cn 111484965 b)。与链霉菌139(streptomyces sp 139)相比，streptomycessp 139d2发酵液中的依博素产量提高了2.1倍。
2、胞外多糖(exopolysaccharides，eps)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物，可以分为由一种单糖构成的同多糖和由2种以上单糖构成的杂多糖，对微生物的生长、定殖、抗逆等生理学过程有重要意义，近年来已被广泛应用于食品、医药、化工等多领域。
技术实现思路
1、本发明的目的为挖掘更多的来自微生物的多糖，尤其是胞外多糖。
2、本发明首先保护一种多糖(即本技术的实施例中依博多糖)，其来自streptomycessp139d2。streptomycessp 139d2为敲除链霉菌139(streptomyces sp 139)中的ste2蛋白的编码基因，获得的ste2基因阻断株。streptomycessp 139d2已在中国发明专利文献cn 111484965 b中公开。经高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测法(hpaec-pad)测定，该多糖含有岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸。
3、所述多糖具体可由岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸组成。
4、上述任一所述多糖的重均分子量mw可为3300-3800kda(如3300-3500kda、3500-3800kda、3300kda、3500kda或3800kda)。
5、上述任一所述多糖的数均分子量mn可为1500-1800kda(如1500-1650kda、1650-1800kda、1500kda、1650kda或1800kda)。
6、上述任一所述多糖的分散系数可为2.0-3.0(如2.0-2.5、2.5-3.0、2.0、2.5或3.0)。
7、上述任一所述多糖的重均分子量mw具体可为3536.5655kda，数均分子量mn具体可为1683.902kda，分散系数具体可为2.1。
8、上述任一所述多糖的异头碳可为β构型。
9、上述任一所述多糖含有吡喃构型和/或糖醛酸。
10、上述任一所述多糖中，岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸的摩尔比可为(4.00-5.00):(3.00-4.00):(30.00-40.00):(30.00-40.00):(2.00-3.00):1.00:(8.00-9.00):(5.00-6.00)。
11、上述任一所述多糖中，岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸的摩尔比具体可为4.54:3.86:36.72:38.94:2.38:1:8.28:5.6。
12、上述任一所述多糖中，葡萄糖、岩藻糖、l-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸残基的连接方式与相对摩尔比具体见表1。
13、上述任一所述的多糖在制备用于预防和/或治疗导致全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征的疾病、病症或功能紊乱的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
14、上述应用中，优选地，所述全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征可由细胞因子风暴引起。
15、上述应用中，优选地，所述导致全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征的疾病、病症或功能紊乱可包括烧伤、重度感染、创伤、大手术、缺血再灌注损伤、dic、胰腺炎、免疫介导的器官损伤或弥散性血管内凝血dic。
16、上述应用中，优选地，所述预防和/或治疗导致全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征的疾病、病症或功能紊乱的药物可表现为存活率提高和/或体内细胞因子含量下降。
17、上述应用中，优选地，所述细胞因子可为促炎细胞因子。
18、上述应用中，优选地，促炎细胞因子可为肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)、il-6、趋化因子和炎性细胞因子中的至少一种。
19、上述任一所述多糖在制备具有抗细胞因子风暴活性的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
20、上述任一所述抗细胞因子风暴活性可表现为体内发生细胞因子风暴的动物或人的存活率提高。
21、上述任一所述抗细胞因子风暴可由诱导剂激活。所述诱导剂可为脂多糖(lps)。脂多糖(lps)能激活单核细胞和/或巨噬细胞释放细胞因子。
22、上述任一所述细胞因子可为促炎细胞因子。所述促炎细胞因子可为肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)、il-6、趋化因子和炎性细胞因子中的至少一种。
23、上述任一所述细胞因子风暴还可由全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征的细胞因子释放导致。
24、本发明还保护上述任一所述多糖的制备方法，可包括如下步骤：
25、(1)发酵培养streptomycessp 139d2，得到发酵液；streptomycessp 139d2为敲除链霉菌139中的ste2蛋白的编码基因，获得的ste2基因阻断株；
26、(2)从步骤(1)获得的发酵液中分离上述任一所述多糖。
27、streptomycessp 139d2已在中国发明专利文献cn 111484965 b中公开。
28、上述制备方法中，所述从步骤(1)获得的发酵液中分离上述任一所述多糖包括如下步骤：
29、(a)收集步骤(1)获得的发酵液的上清；
30、(b)完成步骤(a)后，去除色素；
31、(c)完成步骤(b)后，去除阳离子杂质；
32、(d)完成步骤(c)后，醇沉，收集沉淀；
33、(e)溶解步骤(d)收集的沉淀，去除阴离子杂质，之后蒸馏，获得沉淀；
34、(f)溶解步骤(e)收集的沉淀，进行sephacryl s-400hr凝胶柱层析，收集馏分，该馏分即含有上述任一所述多糖。
35、所述步骤(a)中，收集步骤(1)获得的发酵液的上清通过将发酵液离心实现。离心的参数具体可为3000-5000rpm离心8-15分钟。
36、所述步骤(b)中，所述去除色素通过用x-5大孔吸附树脂层析实现。x-5大孔吸附树脂的用量具体为步骤(1)收集的上清体积的5-7％(如5-6％、6-7％、5％、6％或7％)。所述用x-5大孔吸附树脂层析可使用蒸馏水洗脱。
37、所述步骤(c)中，所述去除阳离子杂质通过用1×7(na+)阳离子交换树脂柱层析实现。1×7(na+)阳离子交换树脂的用量具体为步骤(2)收集的流出液体积的5-7％(如5-6％、6-7％、5％、6％或7％)。所述用1×7(na+)阳离子交换树脂柱层析的洗脱系统可为蒸馏水。
38、所述步骤(d)中，所述醇沉具体为加入2-4倍(如2-3倍、3-4倍、2倍、3倍或4倍)体积的乙醇，静置沉淀。所述静置的时间可为10小时以上。所述收集沉淀通过离心实现。离心的参数具体可为3000-5000rpm离心8-15分钟。
39、所述步骤(e)中，所述溶解步骤(d)收集的沉淀可为用蒸馏水或去离子水溶解步骤(d)收集的沉淀。所述去除阴离子杂质通过用deae sepharose fast flow阴离子交换柱层析实现。所述用deae sepharose fast flow阴离子交换柱层析的洗脱系统可为蒸馏水。
40、所述步骤(f)中，所述溶解步骤(e)收集的沉淀可为用蒸馏水或去离子水溶解步骤(e)收集的沉淀。所述sephacryl s-400hr凝胶柱的制备方法可如下：静置sephacryl s-400hr填料，倾去上层浸泡液，得到湿胶。之后向湿胶中加入去离子水(湿胶和去离子水的体积比为3:1)，搅匀后装柱，去离子水冲洗柱子。
41、所述步骤(f)中，进行所述柱层析时的洗脱系统可为去离子水或蒸馏水。洗脱流速可为1-3ml/min。
42、所述步骤(f)获得的馏分经滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱分析，通过分子量分布图谱发现，步骤(f)获得的馏分中含有均一的上述任一所述的多糖。
43、本文中，所述细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后或由诱导剂激活后引起体液中多种细胞因子如tnf-α、il-1、il-6、il-12、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、mcp-1和il-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭的重要原因。
44、本技术的发明人从streptomycessp 139d2的发酵产物中分离提取得到多糖(3536.5655kda)(即本技术的实施例中依博多糖)，并对依博多糖进行了结构鉴定，包括紫外光谱、红外光谱、平均分子量测定、单糖组成分析、甲基化分析与核磁共振测试。同时药效学研究发现，口服10mg/kg的依博多糖具有显著抗细胞因子风暴活性，基于该活性，依博多糖有望作为药物或者药物组合物的活性成分，用于治疗病毒感染导致的细胞因子风暴、car-t治疗后细胞因子释放综合征等疾病。本发明具有重要的应用价值。
1.一种多糖，其含有岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：所述多糖由岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于：所述多糖的重均分子量mw为3300-3800kda，数均分子量mn为1500-1800kda，分散系数为2.0-3.0。
4.根据权利要求1至3任一所述的多糖，其特征在于：所述多糖的重均分子量mw为3536.5655kda，数均分子量mn为1683.902kda，分散系数为2.1。
5.根据权利要求1至4任一所述的多糖，其特征在于：所述多糖的异头碳为β构型；和/或所述多糖含有吡喃构型和/或糖醛酸。
6.根据权利要求1至5任一所述的多糖，其特征在于：所述多糖中，岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸的摩尔比为(4.00-5.00):(3.00-4.00):(30.00-40.00):(30.00-40.00):(2.00-3.00):1.00:(8.00-9.00):(5.00-6.00)。
7.根据权利要求1至6任一所述的多糖，其特征在于：所述多糖中，岩藻糖、鼠李糖、l-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸的摩尔比为4.54:3.86:36.72:38.94:2.38:1:8.28:5.6。
8.权利要求1至7任一所述的多糖在制备用于预防和/或治疗导致全身炎症反应综合征或car-t治疗后细胞因子释放综合征的疾病、病症或功能紊乱的药物或制备具有抗细胞因子风暴活性的药物中的应用；
9.权利要求1至7任一所述的多糖的制备方法，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述从步骤(1)获得的发酵液中分离权利要求1至7任一所述的多糖包括如下步骤：
