本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统、方法及应用。
背景技术：
1、肺浸润性黏液腺癌(lung invasive mucinous adenocarcinoma，lima)是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)中罕见且独特的组织学亚型。
2、研究发现，lima具有局部侵袭性强、多灶性和转移性高的特点，总体预后较差，给肿瘤学治疗带来了巨大挑战。大量分泌细胞外黏蛋白是lima的一个标志性特征，不仅是其独特的病理特征，而且影响其对各种治疗的反应，包括新兴的免疫治疗。
3、特异性靶向程序性死亡受体配体1(pd-l1)和程序性死亡受体1(pd-1)的免疫检查点抑制剂(icis)的变革性问世使nsclc的治疗发生了革命性的变化。这些疗法在各种nsclc亚型中显示出显著疗效，改变了癌症治疗模式。pd-l1表达和cd8+肿瘤浸润淋巴细胞(tils)已成为重要的生物标志物。
4、其中，pd-l1是一种关键的免疫检查点分子，通常在肿瘤和肿瘤微环境中的免疫细胞中上调，在癌症的免疫逃避策略中发挥关键作用。另一方面，cd8+tils提示针对肿瘤的主动免疫应答，并被认为是肿瘤免疫原性的标志物。
5、尽管对非小细胞肺癌免疫微环境有了相当多的认识，但lima在这一背景下的具体动态仍有待探索。这主要是由于其罕见性和独特的生物学行为，与其他nsclc亚型有显著差异。
6、因此说，针对lima的检测仍然是本领域技术人员急需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明提供了一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统、方法及应用，其旨在填补目前对lima的认识的关键空白，揭示这些生物标志物在预测患者对免疫治疗的反应和对患者进行量身定制治疗方法分层方面的潜在效用，有助于开发更有效和个性化的治疗方案，改善这一具有挑战性的亚型肺癌患者的预后。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、本发明提供了一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统，包括检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润的系统；
4、上述检测系统用于预测肺浸润性粘液腺癌患者的预后，具体用于检测肺浸润性粘液性腺癌组织中pd-l1表达和cd8+t细胞浸润的数量。
5、优选的，作为一种可实施方式；所述pd-l1和cd8抗体为pd-l1和cd8单克隆抗体或者pd-l1和cd8多克隆抗体。
6、优选的，作为一种可实施方式；还包括数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(1)和/或(2)所示的功能：
7、(1)以获取拍照后的待处理组织图像作为检测样本；测定每份标本中pd-l1表达和cd8+t细胞浸润的数量，之后计算待测群体的pd-l1表达的肿瘤阳性评分(tps)和合并阳性评分(cps)，以及cd8+t细胞浸润的阳性率和密度；
8、其中，肿瘤阳性评分(tps)计算为pd-l1阳性肿瘤细胞(呈环周或部分膜性染色)与整个肿瘤细胞的比值乘以100；
9、其中，合并阳性评分(cps)的计算为：总的阳性肿瘤细胞和免疫细胞数之和与总细胞数的比值乘以乘以100；
10、如果检测发现，待测群体的tps≥1％或者cps≥1％均被视为pd-l1表达阳性；
11、其中，cd8+tils阳性率(％)定义为cd8+tils与总细胞的比值，cd8+tils密度(cells/mm2)计算为阳性染色的总t细胞数除以总腔室面积；
12、基于x-tile软件分析，cd8+tils阳性率和密度预测患者rfs的最佳截断值分别为3.6％和142.5个/mm2；待测群体中cd8+t细胞浸润的阳性率低于3.6％的患者组成阴性组，大于或者等于3.6％的患者组成阳性组；待测群体中cd8+t细胞浸润的细胞数低于142.5mm2的患者组成阴性组，待测群体中cd8+t细胞浸润的细胞数大于或者等于142.5mm2的患者组成阳性组；
13、(2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测患者的预后无复发生存期和/或预后总生存期：
14、①“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后无复发生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”；
15、②“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后总生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”。
16、本发明提供了一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测方法，利用上述所述pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统进行检测处理；利用pd-l1和cd8抗体的免疫组化试剂，通过免疫组织化学染色方法检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润实施检测处理。
17、优选的，作为一种可实施方式；通过免疫组织化学染色方法检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润实施检测处理，具体包括如下操作步骤：
18、s10、免疫组织化学染色方法将pd-l1和cd8蛋白作为标记；
19、s20、利用pd-l1和cd8抗体的免疫组化试剂，分析肺浸润性粘液腺癌组织中pd-l1表达和cd8+t细胞浸润的数量，用以预测肺浸润性粘液腺癌患者的预后。
20、优选的，作为一种可实施方式；所述免疫组织化学染色方法将pd-l1和cd8蛋白作为标记，具体包括：
21、s11、获取预测肺浸润性粘液腺癌患者组成的待测群体的离体腺癌组织作为待处理组织；
22、s12、选取待处理组织放入4％多聚甲醛里面固定a-b个小时实现固定处理；
23、s13、选取预设尺寸的待处理组织放入包埋盒中，进行脱水处理：每个染缸液体体积约200ml，每次脱水过程中当前的染缸用于装20个包埋盒，依次进入如下试剂：75％酒精1.5小时、95％酒精1.5小时、95％酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时；
24、s14、打开包埋机，分别开启冷台、冷点、石蜡槽、组织槽进行工作；然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机的组织槽中加热溶解；将脱水后的待处理组织连同包埋盒依次放入包埋机的组织槽中，然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡，然后石蜡饭盒二号，进行三次浸蜡；
25、选取预设尺寸的模具，先调整包埋机的滴蜡速度；然后在模具中滴入液体石蜡，然后从石蜡饭盒二号中拿出浸后的包埋盒，打开用镊子取出待处理组织放入模具中；然后用包埋盒的另一半盖住模具，再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却，得到包埋处理的当前蜡块；
26、s15、打开切片机，固定当前蜡块，调整刀片和蜡块的距离；然后调整切片厚度首次粗切厚度尺寸大于4-um厚度，按照先粗切后细切原则，当检测到当前完整的蜡片并且有待处理组织后切换厚度，调整到4-um厚度；然后操作人员人工接片处理，右手摇动切片，左手用毛笔接片；
27、用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起，放入水槽中展片，水温在40度左右；然后用防脱片载玻片捞起；然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟；
28、s16、待处理组织化学染色，并在显微镜下拍照得到将pd-l1和cd8蛋白作为标记物的图像。
29、优选的，作为一种可实施方式；所述待处理组织化学染色，并在显微镜下拍照得到将pd-l1和cd8蛋白作为标记物的图像，具体包括如下操作步骤：
30、在室温条件进行脱蜡、水化处理：脱蜡时先后进入二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90％乙醇3分钟、80％乙醇3分钟、70％乙醇3分钟；水化处理时，先后进入蒸馏水3分钟*3次，pbs3分钟*3次；
31、热抗原修复，换新的切片架，放入水化后的切片：配置edta缓冲液，将切片置于缓冲液中，放入微波炉进行抗原修复30分钟，最后自然冷却室温；再次进行水化处理：pbs五分钟*2次，蒸馏水3分钟*2次；
32、免疫组化笔画圈:取出待处理组织，甩干水分；用组化笔画圈围住待处理组织；
33、灭活内源酶活性:将切片放入湿盒中，湿盒中加入蒸馏水，滴加3％过氧化氢，室温孵育15分钟；再次进行水化处理：pbs三分钟*3次，蒸馏水水洗三分钟；
34、封闭非特异性位点:甩干水分，吸干水珠，加10％正常血清封闭液，放入湿盒内，静置10分钟；
35、甩掉封闭液，滴加pd-l1或cd8一抗(1:200)盖住待处理组织，然后放入湿盒内4摄氏度过夜；
36、第二天，4度冰箱取出湿盒，室温复温30分钟；再次进行水化处理：pbs三分钟*三次，蒸馏水洗涤三分钟；
37、甩干水分，吸干水珠，滴加二抗一滴或者50微升，室温孵育30分钟；再次进行水化处理：pbs三分钟*三次，蒸馏水水洗三分钟；
38、每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10分钟；再次进行水化处理：pbs三分钟*三次，蒸馏水水洗三分钟；
39、每张片子滴加两滴或者100微升dab溶液，显微镜下观察3-10分钟；染色符合首次染色条件即可终止染色，自来水冲洗；
40、苏木素复染，复染时间1-2分钟，细胞核变蓝色即可终止，自来水或者pbs冲洗反蓝；
41、1％盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗三分钟；
42、脱水:70％酒精1分钟、80％酒精1分钟、95％酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟；
43、凉干片子后滴加适量中性树胶封片，盖上盖玻片；晾干12个小时即可；显微镜下拍照。
44、相应的，本发明还提供了上述检测系统在如下(1)-(6)中的应用：
45、(1)制备用于预测肺浸润性粘液腺癌患者预后无复发生存期的产品；
46、(2)预测肺浸润性粘液腺癌患者预后无复发生存期；
47、(3)制备用于预测肺浸润性粘液腺癌患者预后总生存期的产品；
48、(4)预测肺浸润性粘液腺癌患者预后总生存期；
49、(5)预测肺浸润性粘液腺癌患者预后；
50、(6)制备用于预测肺浸润性粘液腺癌患者预后的产品。
51、优选的，作为一种可实施方式；所述腺癌患者为腺癌患者为i-iii期肺腺癌患者。
52、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
53、1、pd-l1表达和cd8+t细胞浸润与肺浸润性粘液腺癌相关性的发现，为预测肺浸润性粘液腺癌患者预后提供了全新的生物标志物，其中研究发现cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量多的患者预后较好，即较高的cd8+til密度和阳性率是肺浸润性粘液腺癌患者无复发生存期的独立有利预后因素。
54、2、本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照评估和测定肺浸润性粘液腺癌组织中pd-l1的表达和cd8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量，并结合术后随访信息，确定pd-l1的表达和cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量与肺浸润性粘液腺癌患者的生存时间具有相关性，其中cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量能够作为判断肺浸润性粘液腺癌患者预后的生物标志物。对于肺浸润性粘液腺癌患者，可以利用胸腔镜手术获得肺浸润性粘液腺癌组织标本进行cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量的检测，从而评估患者的预后。
55、3、肺浸润性粘液腺癌组织中pd-l1的表达和cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量均是通过绝对定量进行计数，其可靠性和重复性在相当客观，是相对客观和能够反应肿瘤真实世界的预测指标，有望真正应用于的临床预测和指导。本发明实施例建立了利用免疫组化技术检测pd-l1和cd8+细胞浸润的方法,能够客观评估这些指标。结合术后随访数据分析其与生存时间的相关性,为临床应用提供了依据。
56、4、肺浸润性粘液腺癌患者中的cd8+肿瘤浸润淋巴细胞数量与患者的预后显著相关，这对于肺浸润性粘液腺癌患者诊断和治疗具有重要的临床指导意义。这些指标的评估是通过绝对定量计数实现的,相比主观评估更加客观和可靠,能更好地反映肿瘤的实际情况,具有良好的应用前景。
1.一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统，其特征在于，包括检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润的系统；
2.根据权利要求1所述的一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统，其特征在于，所述pd-l1和cd8抗体为pd-l1和cd8单克隆抗体或者pd-l1和cd8多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统，其特征在于，还包括数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(1)和/或(2)所示的功能：
4.一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测方法，其特征在于，利用上述权利要求1-3任一项所述的pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测系统进行检测处理；利用pd-l1和cd8抗体的免疫组化试剂，通过免疫组织化学染色方法检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润实施检测处理。
5.根据权利要求4所述的一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测方法，其特征在于，通过免疫组织化学染色方法检测pd-l1表达和cd8+t细胞浸润实施检测处理，具体包括如下操作步骤：
6.根据权利要求5所述的一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测方法，其特征在于，所述免疫组织化学染色方法将pd-l1和cd8蛋白作为标记，具体包括：
7.根据权利要求6所述的一种pd-l1表达和cd8+t细胞浸润在肺浸润性粘液腺癌预后检测方法，其特征在于，所述待处理组织化学染色，并在显微镜下拍照得到将pd-l1和cd8蛋白作为标记物的图像，具体包括如下操作步骤：
8.权利要求1-3任一所述的系统在如下(1)-(6)中的应用：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述腺癌患者为i-iii期肺腺癌患者。
