本发明属于药物分析，具体地，涉及一种利用hplc-ms/ms（高效液相色谱-串联质谱技术）测定氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉在血浆中含量的方法。
背景技术：
1、高血压是最常见的慢性病之一，也是心脑血管最主要的危险因素，其中脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等为主要并发症。国内外实践证明，高血压是可以预防和控制的疾病。目前用于常见的降压药主要有血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素-2受体阻滞剂（arbs）、钙通道阻滞剂、利尿剂等。根据高血压患者病情的紧急轻重程度选用不同的药物，中重度及危重度患者需要联合用药。
2、苯磺酸氨氯地平是第2代长效的双氢吡啶类钙拮抗药，可舒张冠状血管和全身血管，增加冠脉血流量，降低血压，临床上主要用于治疗高血压和心绞痛。盐酸贝那普利肝内水解为贝那普利拉，成为一种竞争性的血管紧张素转换酶抑制剂，使血管阻力降低，醛固酮分泌减少，血清肾素活性增高，还通过抑制缓激肽降解使血管阻力降低，产生降压作用。为了提高疗效，降低心血管事件的发生率，减少靶器官损伤，通常将血管紧张素转换酶抑制剂与钙拮抗剂联合用药治疗高血压，安全有效，具有良好的耐受性。复方苯磺酸氨氯地平/盐酸贝那普利胶囊是由诺华制药公司研制成功，于1995年获fda批准上市。
3、现有测定贝那普利及贝那普利拉的方法主要有气相质谱法（gcms）和液质联用法（lcms）。现有相关研究文献1：贝那普利、氨氯地平在健康受试者中的药代动力学相互作用研究（j. x. sun. a. cipriano, et al. pharmacokinetic interaction study betweenbenazepril and amlodipine in healthy subjects. eur j clin pharmacol (1994)47:285-289），利用吸附法提取贝那普利、及贝那普利拉后用重氮甲烷衍生，再经gcms法测定贝那普利及其代谢物。以上操作比较繁琐。文献2：用液质联用法同时测定血浆中那普利及贝那普利拉（weitao xiao, bo chen, et al. simultaneous determination ofbenazepril hydrochloride and benazeprilat in plasma by high-performanceliquid chromatography/electrospray-mass spectrometry. journal ofchromatography b, 814 (2005) 303-308），利用常规c18色谱柱(250mm×4.6, 5μm)，线性范围约6.7~670ng/ml，色谱条件效率偏低、线性范围较窄。
4、现有文献测定氨氯地平含量时，经固相萃取、液液萃取等方法提取，经gc、hplc或lc-ms等检测。文献1利用液液萃取法提取氨氯地平后用酰氯衍生，通过gc检测，操作繁琐。文献3：用lc-ms/ms法测定复方制剂中氨氯地平、缬沙坦及氢氯噻嗪含量的生物等效性研究（jaivik v. shaha, jignesh m. parekha, et al. application of an lc-ms/msmethod for the analysis of amlodipine, valsartan and hydrochlorothiazide inpolypill for a bioequivalence study. journal of pharmaceutical analysis 7(2017) 309-31），利用固相萃取方法提取氨氯地平，操作成本偏高。
5、同时测定3个待测物的文献较少，上述文献1属于早期的研究，提取待测物后经衍生后用毛细管分离检测，操作繁琐。文献4：同时测定氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉的uplc-esi-ms/ms方法的开发、优化和验证：生物等效性研究中的应用（mamdouh r. rezka,kamal a. badr. development, optimization and validation of a highly sensitivesensitive uplc-esi-ms/ms method for simultaneous quantification ofamlodipine, benazeprile and benazeprilat in human plasma: application to abioequivalence study. journal of pharmaceutical and biomedical analysis 98(2014) 1-8），使用血浆总量高至1ml，氨氯地平的提取溶剂乙醚沸点低、较不安全；同时氨氯地平定量下限为0.1ng/ml，贝那普利及贝那普利拉定量下限均为5ng/ml，灵敏度偏低。此外，以上文献均未针对残留提出明确的解决措施。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种方法，不仅可以同时检测血浆中氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉3种药物的浓度，而且具有灵敏度高、线性范围宽、无残留、血浆用量少、基质效应低、液相条件高效耐用、稳定的优点，满足氨氯地平贝那普利复方制剂的生物等效性试验要求。
2、本发明提供了一种利用hplc-ms/ms（高效液相色谱-串联质谱技术）同时测定血浆中氨氯地平（下文简称aml，cas号：88150-42-9）、贝那普利（下文简称ben，cas号：86541-75-5）及贝那普利拉（下文简称bnt，cas号：86541-78-8）含量的方法。
3、本发明可同时测定氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉，具有灵敏度高、线性范围宽、无残留、血浆用量少、基质效应低、方法耐用、稳定的优点，满足氨氯地平贝那普利复方制剂的生物等效性试验要求。
4、本发明提供了测定血浆中氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉含量的方法，所述的方法按如下步骤进行：
5、1）样品处理：冰水浴条件下，取含有抗凝剂的血浆样品，加入同位素内标工作溶液，混匀，加入ph调节剂；再加入萃取剂，混匀；离心后冷冻，分离上清液加入长玻璃试管；吹干上清液样品。取含有抗凝剂的血浆样品，加入同位素内标工作溶液，混匀，加入沉淀剂，混匀；离心后取上清液加入吹干的长玻璃试管，加入稀释剂，混匀；
6、2）样品分离：步骤1）处理后的样品经液相色谱系统分离；
7、色谱条件：反相窄径色谱柱，含酸的水溶液为流动相a，甲醇-乙腈溶液为流动相b，强洗针液为含酸的有机相-水相的混合溶液，弱洗针液为有机溶液或有机相-水相的混合溶液。
8、3）样品检测：步骤2）分离后的样品通过质谱检测；
9、4）数据分析：使用内标法将步骤3）中所测得的分析物与内标物峰面积进行定量分析。
10、在一些实施方案中，步骤1）所述萃取剂为甲基叔丁基醚、甲基叔丁基醚和无水乙醚的混合溶剂、或甲基叔丁基醚和三氯甲烷的混合溶剂；任选地，所述无水乙醚和三氯甲烷的混合溶剂中无水乙醚与三氯甲烷的体积比为7:3；任选地，甲基叔丁基醚和三氯甲烷的混合溶剂中甲基叔丁基醚与三氯甲烷体积比为7:3。。
11、在一些实施方案中，步骤1）所述沉淀剂为含酸的乙腈溶液，其中酸为甲酸、乙酸、或其混合物，酸的体积占比为0.1%~2.0%。
12、在一些实施方案中，步骤1）所述稀释剂为含酸和有机相的水溶液，其中酸为甲酸、乙酸、或其混合物，酸的体积占比为0.1%~2.0%，所述有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合，有机相体积占比为10%~50%。
13、在一些实施方案中，步骤2）所述液相色谱系统的色谱柱为反相亲水色谱柱，填料类型为增加亲水基团的c18，内径2~3mm，颗粒直径1.8~3.5μm。
14、在一些实施方案中，步骤2）所述液相色谱系统的流动相初始洗脱比例为：有机相与水相的体积比为（30~50）：（70~50）；其中，所述水相为含酸的水溶液，其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸指甲酸、乙酸或三氟乙酸，任选地，所述水相还可含有缓冲盐；所述有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合。
15、在一些实施方案中，步骤2）所述液相色谱系统的弱洗针液为含酸的有机相与水相的混合溶液。其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；有机相的体积占比为其总体积的10%~100%；所述有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合。
16、在一些实施方案中，步骤2）所述液相色谱系统的强洗针液为含酸的有机相与水相的混合溶液。其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合。
17、在一些实施方案中，步骤2）所述色谱条件为：以含酸的水相和有机相的混合溶剂作为流动相，将样品经反相亲水色谱柱洗脱分离，柱温25～50℃，流速0.5～1.2ml/min；所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；有机相为甲醇、乙腈其之间的组合。任选地，所述含酸的水相为0.1% v/v甲酸水溶液；所述有机相为50% v/v甲醇乙腈溶液。
18、另一方面，本发明提供了测定血浆中氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉含量的方法用于以药动学参数为终点的生物等效性评价或药代动力学研究的用途。
19、本发明的有益结果在于：
20、本发明提供了灵敏度、准确度、精密度、残留均符合要求的生物分析方法。此外，全血基质中分析物稳定性、质控血浆样品中分析物冰水浴放置的稳定性、质控血浆样品中分析物1个月的长期稳定性、制备后样品的稳定性均符合要求。可应用于氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉以药动学参数为终点的生物等效性评价。
1.测定血浆中氨氯地平、贝那普利及贝那普利拉含量的方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，步骤1）所述萃取剂为甲基叔丁基醚、甲基叔丁基醚和无水乙醚的混合溶剂、或甲基叔丁基醚和三氯甲烷的混合溶剂。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤1）所述沉淀剂为含酸的乙腈溶液，其中酸为甲酸、乙酸、或其混合物，酸的体积占比为0.1%~2.0%。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤1）所述稀释剂为含酸和有机相的水溶液，其中酸为甲酸、乙酸、或其混合物，酸的体积占比为0.1%~2.0%；所述有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合，有机相体积占比为10%~50%。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，步骤2）所述液相色谱系统的色谱柱为反相亲水色谱柱，填料类型为增加亲水基团的c18，内径2~3mm，颗粒直径1.8~3.5μm。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，步骤2）所述液相色谱系统的流动相初始洗脱比例为：有机相与水相的体积比为（30~50）：（70~50）；其中，所述水相为含酸的水溶液，其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸指甲酸、乙酸或三氟乙酸，任选地，所述水相还含有缓冲盐；所述有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，步骤2）所述液相色谱系统的弱洗针液为含酸的有机相与水相的混合溶液。其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述有机相的体积占比为其总体积的10%~100%，所述有机相为甲醇、乙腈、异丙醇及其之间的组合。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，步骤2）所述液相色谱系统的强洗针液为含酸的有机相与水相的混合溶液。其中，所述酸的体积占比为其总体积的0.1%~2%，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述有机相为甲醇、乙腈、异丙醇及其之间的组合。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，步骤2）所述色谱条件为：以含酸的水相和有机相的混合溶剂作为流动相，将样品经反相亲水色谱柱洗脱分离，柱温25～50℃，流速0.5～1.2ml/min；所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；有机相为甲醇、乙腈及其之间的组合；任选地，所述含酸的水相为0.1% v/v甲酸水溶液；所述有机相为50% v/v甲醇乙腈溶液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述方法用于以药动学参数为终点的生物等效性评价或药代动力学研究的用途。
