本发明涉及医药，具体涉及一种灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法。
背景技术：
1、糖尿病肾病(dn)是慢性代谢性疾病的一种罕见并发症，在全球范围内造成了重大的公共卫生负担，而在中国，糖尿病肾病的发病率和患病率在过去十年中急剧上升。据估计，中国糖尿病合并慢性肾脏病(ckd)的患者人数已达2430万。该病的临床特征主要是持续蛋白尿和肾功能进行性减退，晚期可发展到需要透析或肾移植等肾脏替代治疗。目前对dn病理机制的研究表明，它与多种因素有关：1)多醇途径的激活、蛋白激酶c的活化以及糖代谢异常导致的糖基化终产物的形成和积累，从而导致疾病早期的肾小球高滤过和晚期的肾小球硬化；2)高血糖引起的高渗透压导致肾血流量改变、肾小球内皮细胞和上皮细胞受损、angⅱ和tgf-β过度表达。高糖引起的高渗透压导致肾血流量改变，肾小球内皮细胞和上皮细胞受损，angⅱ和tgf-β过度表达，从而导致细胞外基质增加和肾小球硬化；3)糖尿病患者体内多种炎症介质导致肾小球损伤，加速肾小球硬化的发展；4)其他因素，包括氧化应激、细胞凋亡、粘附分子等，都参与了dn的发病过程。
2、根据传统医学理论，dn属于“尿浊”、“水肿”、“关格”等范畴。认为其主要病机在于“三焦壅塞”认为其主要病因在于“三焦壅塞，精微代谢失调”。在中医学体系中，肾不仅与排泄功能有关，还被认为是人体的“先天之精”，与生殖、骨骼、耳等功能密切相关。因此，中医治疗dn的策略是调和阴阳，养护肾阴，通过改善代谢紊乱恢复肾脏健康。
3、灵芝是一种传统中草药。在传统医学中，灵芝被广泛用于调节机体、提高免疫力、延缓衰老和治疗多种疾病。其药用成分包括：多糖、三萜类、多酚和蛋白质。其中，多糖和三萜类化合物在药理学中发挥着重要作用。三萜类化合物具有抗炎、抗癌、降血压、降血脂、保肝、抗血小板凝集、抑制补体、抗病毒等作用。
4、灵芝三萜类化合物通过多种机制显示出对dn的潜在治疗作用。灵芝三萜类化合物可有效调节血糖和血脂水平，减缓糖尿病及其并发症的进程。研究发现，灵芝三萜类化合物能有效降低大鼠组织中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白细胞介素-6(il-6)等炎症因子的水平，同时通过抑制糖皮质激素诱导的磷酸化蛋白激酶b(akt)和核因子-κb(nf-κb)的表达，进一步减轻炎症反应。此外，研究还发现灵芝三萜类化合物通过抑制氧化应激和减少活性氧(ros)的产生，保护小鼠组织免受损伤。
5、本发明利用网络药理学和分子对接技术，结合动物实验，系统地揭示了灵芝三萜类化合物对dn的治疗作用及其潜在的作用机制，特别是在抑制炎症、减轻氧化应激、自噬调节和调控mirna表达等方面的作用机制。这些发现不仅为灵芝三萜类化合物在dn治疗领域的应用提供了科学依据，也为后续相关药物的开发和临床应用奠定了基础。此外，本研究采用网络药理学与分子对接技术相结合的方法探讨中药成分的作用机制，为今后的中药研究提供了新的视角和工具。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，筛选出akt、mapk、stat3、hsp90等关键靶点发挥肾脏保护作用。分子对接结果进一步验证了灵芝三萜类化合物的有效成分可与核心靶点结合。动物实验证实，灵芝三萜类提取物能降低糖尿病肾病(dn)小鼠的血糖水平和尿蛋白含量，减轻肾脏损伤和纤维化。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
3、一种灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，包括以下步骤：
4、s1：筛选活性药物成分并获取其靶点；
5、s2：获取疾病目标和交叉目标，以“糖尿病肾病”为关键词，在genecards、omim和ttd数据库中搜索目标信息，物种设置为“智人”。以得分(相关性得分)≥8为筛选条件，处理从各数据库获得的基因数据，以获取药物与疾病之间的交叉靶标信息；
6、s3：构建和分析蛋白质-蛋白质相互作用网络；
7、s4：go功能和kegg通路富集分析，将交叉靶标导入david数据库，选择物种为“人类”，然后从生物过程(bp)、细胞成分(cc)和分子功能(mf)的角度对重叠靶标进行go富集分析。以p≤0.05进行筛选，并使用在线绘图工具进行可视化分析；
8、s5：从pubchem数据库中获取所选物质的二维结构，使用avogadro软件构建配体的三维框架，然后使用autodocktools-1.5.6软件添加电荷和显示可旋转键，并将其导入chimera 1.17.3去除溶剂和配体。使用autodocktools-1.5.6为结构添加氢原子。使用autodock软件进行分子对接，评估结合能，并记录每轮的最小结合能作为最终结果；
9、s6：动物分组、建模和给药，进行尿蛋白检测、小鼠行为学实验，基于肾脏病理结果研究相关关键靶点蛋白和mrna表达的影响。
10、进一步的，所述步骤s1具体包括：通过查阅相关文献，确定目前从白灵芝三萜类化合物中分离出来的成分。对于每种活性化合物，通过pubchem获取其canonical smiles编号，或使用chemdraw绘制其结构并导出canonical smiles编号。将这些信息上传到swissadme平台。首先，将胃肠道吸收(giabsorption)设为“高”，作为药物被吸收的条件。接着，设置五个药物相似性预测规则(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)，然后将有效三萜化合物的canonical smiles编号上传到swisstargetprediction服务器，并在“智人”条件下进行靶点预测。将概率大于0的预测基因靶点视为潜在药物靶点。
11、进一步的，所述步骤s3具体包括：将交叉靶标和活性成分导入string 11.0数据库，将物种限定为人类，以获得靶蛋白之间的相互作用关系，并计算其度和间性中心度值。获取白灵芝治疗dn关键靶点的ppi网络关系，并将结果保存为tsv格式。将string中的ppi网络导入cytoscape 3.71，使用cytohubba插件查找度值排名前25和前10的关键基因，并将分析结果可视化。
12、进一步的，所述步骤s5中动物分组、建模和给药具体包括：15只spf级8周龄雄性db/db小鼠(40g±5g)和5只spf级8周龄雄性c57bl/6j小鼠(20g±5g)购自北京华富康生物技术有限公司。小鼠饲养在温度为(22±2)℃、湿度为(50％±10％)的环境控制室中，实验期间允许小鼠自由饮水和进食。所有动物实验均经成都医学院第一附属医院实验动物福利伦理审查委员会审查批准。
13、选取15只db/db小鼠和5只c57bl/6j小鼠，经过一周的适应性喂养后，随机分为空白组、模型组、灵芝提取物低剂量组(0.58[g/(kg d)])和灵芝提取物高剂量组(2.3[g/(kgd)])。每组五只动物，连续给药8周。空白组为雄性c57bl/6j小鼠，模型组为雄性db/db小鼠。低剂量组灌胃灵芝提取物0.58[g/(kg d)]，高剂量组灌胃灵芝提取物2.3[g/(kg d)]。实验期间对小鼠进行血糖和体重检测：每周使用葡萄糖检测试剂盒(abcam)测量尾静脉空腹血糖水平，并测量小鼠体重，表明实验开始时各组小鼠的糖尿病严重程度相匹配。空腹时间为6小时，从早上7点持续到下午1点，只提供水，下午1点从尾静脉抽血。在我们的研究中，空腹血糖水平大于20mmol/l即为糖尿病。实验结束后处死小鼠，提取尿液和肾组织用于下一步实验。
14、进一步的，所述步骤s5还包括western印迹检测，用ripa法提取总蛋白，用bca试剂盒测定蛋白浓度，制备10％sds-page凝胶、样品蛋白和maker。电泳后，将膜转移到pvdf膜上，用5％脱脂奶粉在室温下封闭2小时，抗原封闭后，用一抗在4℃下孵育过夜。一抗采用：抗-akt抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号1335)、抗-p-akt抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst；编号9448)、抗-stat3抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst；编号9858)、stat3抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号4413)，抗p-stat3抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号1335)，抗hsp90抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号1325)，抗mapk1抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号4234)、抗src抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000；cst，编号9336)、抗esr1抗体(小鼠单克隆抗体；1：1000.蛋白条带用ecl显色，用imagej软件分析条带灰度值，用条带与内参照物(β-actin)的灰度比值计算目标蛋白的相对表达量。
15、本发明的有益效果：
16、本发明利用网络药理学和分子对接技术系统地筛选灵芝三萜类化合物的活性成分及其潜在靶点；通过genecards、omim和ttd数据库，系统获取与糖尿病肾病相关的靶点信息，并对这些靶点进行关联分析。此方法提高了数据处理和分析的效率，避免了传统实验方法中可能出现的资源浪费。通过swisstargetprediction服务器进行靶点预测，并结合avogadro和autodocktools等工具进行分子对接。此技术路线不仅确保了筛选结果的严谨性和科学性，而且能够准确确定灵芝三萜类化合物的潜在活性和靶向作用。
17、本发明筛选出了src、stat3、akt1、mapk1、hsp90aa1、esr1、pik3ca、mapk8、stat1和akt2多个关键靶点，进行联合干预治疗，这些靶点在糖尿病肾病的不同病理过程中都起到了关键作用，通过多靶点联合治疗能够同时干预多个病理环节。例如，akt在细胞存活和代谢调控中起重要作用，而mapk信号通路则与细胞增殖和分化密切相关。通过联合干预，可以减轻糖尿病肾病引起的肾小球硬化和纤维化，从而提高治疗效果。单靶点治疗可能引起的耐药性和副作用问题通过多靶点策略得以缓解，从而提高治疗的安全性和有效性。例如，stat3和hsp90的联合干预能够有效抑制炎症反应，进一步减轻糖尿病导致的肾损伤。
18、通过动物实验本发明验证了灵芝三萜类化合物在实际生物环境中的显著效果：动物实验采用严格的随机分组和适应性喂养，使用spf级雄性db/db小鼠和c57bl/6j小鼠，对比空白组和模型组，灵芝提取物低剂量组和高剂量组，确保了实验结果的可靠性和科学性。实验结果显示，高剂量组小鼠在灌胃灵芝提取物后，血糖水平和尿蛋白含量显著降低，糖尿病肾病引起的肾小球硬化和肾组织纤维化显著减轻。这表明，灵芝三萜类化合物具有突出的肾脏保护作用，直接验证了本发明的有效性。
19、本发明通过go功能和kegg通路富集分析，揭示了灵芝三萜类化合物在dn治疗中的分子机制：通过western印迹检测，验证了灵芝三萜类化合物对相关蛋白如p-akt、p-stat3等的表达抑制作用。研究表明，灵芝三萜类化合物可以通过抑制炎症因子如tnf-α和il-6，减轻炎症反应，并通过减少活性氧(ros)的产生，减轻氧化应激，从而保护肾组织免受损伤。灵芝三萜类化合物还通过调节自噬相关蛋白和mirna的表达，进一步抑制细胞凋亡和肾小球硬化。例如，研究发现其能够调控自噬相关基因的表达，促进细胞自噬，从而减少糖尿病引起的细胞损伤。
20、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
1.一种灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括：通过查阅相关文献，确定目前从白灵芝三萜类化合物中分离出来的成分；对于每种活性化合物，通过pubchem获取其canonical smiles编号，或使用chemdraw绘制其结构并导出canonical smiles编号；将这些信息上传到swissadme平台；首先，将胃肠道吸收设为“高”，作为药物被吸收的条件；接着，设置五个药物相似性预测规则lipinski、ghose、veber、egan、muegge，然后将有效三萜化合物的canonical smiles编号上传到swisstargetprediction服务器，并在“智人”条件下进行靶点预测；将概率大于0的预测基因靶点视为潜在药物靶点。
3.如权利要求1所述的灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，其特征在于：所述步骤s3具体包括：将交叉靶标和活性成分导入string 11.0数据库，将物种限定为人类，以获得靶蛋白之间的相互作用关系，并计算其度和间性中心度值；获取白灵芝治疗dn关键靶点的ppi网络关系，并将结果保存为tsv格式；将string中的ppi网络导入cytoscape3.71，使用cytohubba插件查找度值排名前25和前10的关键基因，并将分析结果可视化。
4.如权利要求1所述的灵芝三萜类化合物干预糖尿病肾病机制的研究方法，其特征在于：所述步骤s5中动物分组、建模和给药具体包括：选取15只db/db小鼠和5只c57bl/6j小鼠，经过一周的适应性喂养后，随机分为空白组、模型组、灵芝提取物低剂量组0.58[g/(kgd)]和灵芝提取物高剂量组2.3[g/(kg d)]；
