本发明属于微生物，具体涉及一种筛选土传青枯菌群体感应抑制剂的红色荧光报告体系及其构建和应用。
背景技术：
1、土传病害是限制农业可持续发展的一个难题，这些造成土传病害的病原菌通常存在于宿主植物的根际，通过侵染植物根系从而使植物发病，导致作物产量下降，严重时甚至绝收(fiers m,edel-hermann v,chatot c,et al.potato soil-borne diseases.areview[j].agronomy for sustainable development,2012,32(1):93-132；delgado bmanuel,guerra c a,cano d c,et al.the proportion of soil-borne pathogensincreases with warming at the global scale[j].nature climate change,2020,10(6):550-+)。其中土传青枯病是由青枯菌引起的一种危害性极高的土传病害，其分布范围广，宿主众多，对我国部分经济作物安全生产造成巨大威胁(jiang g f,wei z,xu j,etal.bacterial wilt in china:history,current status,and future perspectives[j].frontiers in plant science,2017,8；wang j n,raza w,jiang g f,et al.bacterialvolatile organic compounds attenuate pathogen virulence via evolutionarytrade-offs[j].isme journal,2023,17(3):443-452.)。
2、研究表明青枯菌拥有两套群体感应系统：酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserinelactone，ahl)系统和三羟基棕榈酸甲酯(3-oh pame)系统。三羟基棕榈酸甲酯系统由phcbsr合成组分和调控因子phca构成。其中，phcb负责合成信号分子3-oh pame/mame，phcs负责接收感知信号分子，当3-oh pame/mame的浓度超过一定阈值，phcs便激活phcr，进而解除phcr对phca的抑制，而phca调节着与青枯菌入侵根际过程密切相关的毒力行为。(peyraud r,cottret l,marmiesse l,gouzy j,genin s.a resource allocation trade-off between virulence and proliferation drives metabolic versatility in theplant pathogen ralstonia solanacearum[j].plos pathogens,2016,10；)青枯菌群体感应抑制剂可以抑制或干扰群体感应系统的正常运行，阻断细菌毒力因子的表达从而防控土传病害。然而，目前关于青枯菌群体感应抑制剂的筛选手段都缺乏直观性和简洁性，亟需一种新型的检测方法来取代。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种筛选土传青枯菌群体感应抑制剂的红色荧光报告体系及其构建与应用，本发明的报告体系可以直观地检测青枯菌群体感应系统表达情况从而筛选青枯菌群体感应抑制剂。
2、本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
3、一种筛选土传青枯病菌群群体感应抑制剂的红色荧光报告体系，所述报告体系通过如下步骤构建：从含有mcherry的质粒pyc12-mcherry上扩增出mcherry片段，然后将该片段与phca的直接转录靶点xpsr的启动子区域融合，再将融合后的片段先后连接至pbluescript ii ks+质粒载体和pyc12-gm质粒载体上，得到质粒pyc12-xpsr-mcherry-gm，转化土传植物致病菌，筛选获得报告体系。
4、在具体的实施方案中，所述的土传植物致病菌为青枯菌，更具体为茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)ql-rs1115。
5、在具体的实施方案中，所述报告体系通过如下步骤构建：
6、步骤1，融合片段的获取：首先使用引物对mcherry-f/mcherry-r从含有mcherry的质粒pyc12-mcherry上扩增mcherry片段，然后通过融合pcr将该片段与xpsr的启动子区域的片段融合，得到mcherry与xpsr的融合片段；
7、步骤2，pyc12-xpsr-mcherry-gm质粒的构建：将步骤1获取的融合片段经过ecor v酶切位点连接至pbluescript ii ks+质粒载体上，再通过hind iii和bamh i双酶切获得所需片段后连接至经同样双酶切的pyc12-gm质粒载体，得到质粒pyc12-xpsr-mcherry-gm；
8、步骤3，ql-rs1115-xpsr-mcherry：制备青枯菌ql-rs1115的感受态细胞，利用电击法将步骤2构建成功的pyc12-xpsr-mcherry-gm质粒转入至ql-rs1115中，利用含有25μg/ml庆大霉素的bg培养基筛选ql-rs1115-xpsr-mcherry菌株。
9、青枯菌群体感应系统由phcbsr合成组分和调控因子phca构成，xpsr是调节胞外多糖的关键基因，受phca直接调控，其表达量与phca表达量呈正相关关系，而青枯菌胞外多糖产量与其致病力呈显著正相关关系，因此本发明通过xpsr表达情况来鉴定筛选群体感应抑制剂，使用群体感应抑制剂处理ql-rs1115-xpsr-mcherry后，青枯菌群体感应受到抑制，xpsr表达减弱，mcherry的荧光信号也随之减弱，即可用ql-rs1115-xpsr-mcherry荧光信号的强弱来筛选青枯菌群体感应抑制剂。
10、基于上述原因，在验证报告体系是否可以表征青枯菌群体感应能力时，首先使用青枯菌自身修复能力构建青枯菌ql-rs1115的δphcb突变体(ql-rs1115-dphcb)，δphcb突变体本身无法正常表达群体感应系统，在补充外源群体感应信号时才可以恢复群体感应系统的表达。然后将phca的直接转录靶点xpsr(同时也是胞外多糖基因表达的启动子)的启动子区域与编码红色荧光的报告基因的mcherry分别连接到puc18-mini-tn7t-gm质粒上，通过电激分别转入ql-rs1115-dphcb后，利用抗生素培养基筛选构建成功的菌株，得到ql-rs1115-dphcb-xpsr-mcherry；然后使用青枯菌群感信号3-oh mame处理ql-rs1115-dphcb-xpsr-mcherry，检测红色荧光信号的表达情况。处理后的ql-rs1115-dphcb-xpsr-mcherry红色荧光信号增强，表明本发明构建的报告菌株可以用来表征青枯菌的群体感应表达情况。
11、在具体的实施方案中，所述步骤1中，扩增mcherry基因用到引物如下：
12、mcherry-f：tccggagggaaattaccgaaatggtgagcaagggcgagga，如seq id no:1所示；
13、mcherry-r：ttacttgtacagctcgtcca，如seq id no:2所示。
14、在具体的实施方案中，所述步骤1中，融合xpsr与mcherry时，上游基因xpsr的反向引物为：
15、xpsr-rm：tcctcgcccttgctcaccatttcggtaatttccctccgga，如seq id no:3所示。
16、在具体的实施方案中，bg培养基为：b培养基加2～3％(w/w)琼脂和5g/l葡萄糖，115℃高压灭菌30min。
17、在具体的实施方案中，b培养基为：酪蛋白氨基酸1g、蛋白胨10g、酵母粉1g、去离子水1000ml，调节ph 7.2～7.4，121℃高压灭菌20min。
18、第二方面，本发明还保护前文所述的报告体系在筛选群体感应抑制剂中的应用。
19、本发明还保护前文任一所述的报告体系在制备筛选群体感应抑制剂的试剂盒中的应用。
20、第三方面，本发明还保护利用前文任一所述的报告体系筛选群体感应抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤：将待筛选的群体感应抑制剂与前文任一所述的报告体系共培养，将测定的荧光信号与对照进行比较即可。
21、xpsr是青枯菌群体感应系统的下游基因，是青枯菌胞外多糖基因的启动子，通过插入到xpsr区域的mcherry红色荧光信号，可以表征xpsr和群体感应的表达，当群体感应增强时，下游的mcherry的表达也会上调，红色荧光信号增强；群体感应削弱时，下游的mcherry的表达就会下调，红色荧光信号削弱，即可以筛选到待定的群体感应抑制剂。
22、有益效果
23、本发明提供了一种筛选群体感应抑制剂的报告体系ql-rs1115-xpsr-mcherry，通过ql-rs1115-xpsr-mcherry报告体系可以直观的评估青枯菌的群体感应系统的表达情况并筛选出群体感应抑制剂；本发明可通过ql-rs1115-xpsr-mcherry报告体系评估群体感应抑制剂对青枯菌致病力强弱的影响。
