本发明属于生物检测领技术域，具体涉及到一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测系统及检测方法。
背景技术：
1、妥布霉素是一种氨基糖苷类抗生素，在人类临床实践和兽医中广泛用于治疗细菌感染。滥用妥布霉素可能对人类生命和健康造成不可逆转的副作用，包括肾毒性、神经肌肉阻滞和超敏反应。由于妥布霉素分子缺乏发光或荧光基团，基于仪器的分析方法如高效液相色谱(hplc)和液相色谱-质谱(lc-ms)对妥布霉素进行检测灵敏度不足，存在很大挑战。
2、crispr-cas(簇状正则间隔短回文重复序列及其相关的cas蛋白)是一种显著的适应性免疫机制，存在于许多细菌和古细菌中。除了基因组编辑，该系统还被开发为强大的分子诊断工具。在不同的crispr系统中，crispr-cas12a(又称cpf1)表现出高效的核酸内切酶活性，反式裂解非目标单链dna。crispr-cas12a系统与功能核酸(如适配体等)的结合，促进了许多基于crispr-cas12a系统的非核酸检测方法的开发，这些方法已显示出良好的分析性能。
3、杂交链式反应(hybridization chain reaction，hcr)是一种等温扩增方法。该反应可在无酶参与的情况下，通过不断打开两个发卡dna，扩增得到长双链dna。杂交链式反应作为crispr-cas12a系统上游的信号扩增方法，主要问题是crispr-cas12a系统的识别序列和pam位点均存在与发卡dna中，在杂交链式反应没有被激活的情况下，作为杂交链式反应元件两个发卡dna，也有可能激活crispr-cas12a系统的核酸酶剪切活性，产生非特异性信号，导致检测背景高，灵敏度低等问题。因此，对发卡dna中crispr-cas12a系统的识别序列及pam位点的优化十分必要。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测系统。
4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测系统，其特征在于，包括：核酸探针tob-ap-5、信号扩增核酸元件h1、信号扩增核酸元件h2、lbcas12a蛋白、crrna、f-q报告探针；
5、其中，所述识核酸探针tob-ap-5为妥布霉素识别元件；信号扩增核酸元件h1和h2为链置换等温扩增反应元件；f-q荧光报告探针为两端修饰了荧光基团及荧光淬灭基团的单链dna，是lbcas12a蛋白的反式剪切底物。
6、作为本发明所述妥布霉素检测系统的一种优选方案，其中：所述tob-ap-5探针序列如seq id no.1所示；h1序列如seq id no.2所示；h2序列如seq id no.3所示；crrna序列如seq id no.4；f-q报告探针序列如seq id no.5所示。
7、作为本发明所述妥布霉素检测系统的一种优选方案，其中，所述识别探针tob-ap-5能够特异性识别妥布霉素，并诱发后续扩增反应；
8、作为本发明所述妥布霉素检测系统的一种优选方案，其中，所述信号扩增核酸元件h1包含crispr-cas12a系统的识别序列，且该识别序列中的10个核苷酸(5’-tatagtacag-3’)存在与h1的环区；
9、本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测方法。
10、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素的检测方法，其特征在于，所述检测方法为：
11、将tob-ap-5探针在缓冲液a中稀释至浓度为10μm，95℃加热5分钟，后缓慢降至室温备用；
12、将h1和h2在缓冲液a中分别稀释至10μm，95℃加热5分钟，后缓慢降至室温备用；
13、取0.8μl制得退火的tob-ap-5，加入2.0μl不同浓度的妥布霉素标准溶液或待测溶液，1.0μl制得退火的h1，1.0μl制得退火的h2，使用缓冲液b补齐到终体积20μl，并在37℃下孵育反应2小时，得到反应液1；
14、取2.0μl浓度为800nm的lbcas12a蛋白、2.0μl浓度为1μm的crrna、2.0μl浓度为5μm的f-q报告探针、2μl 10×缓冲液c和11μl水，混合后在室温下静置孵育5分钟，然后加入1μl制得的反应液1，37℃下反应2小时，在65℃灭活10分钟，后利用荧光分光光度计测量荧光信号；
15、作为本发明所述检测方法的一种优选方案，其中：所述缓冲液a的配方为：25mmtris-hcl,500mm nacl，ph＝7.4。
16、作为本发明所述检测方法的一种优选方案，其中：所述缓冲液b的配方为：50mm乙酸钾，20mm tris-乙酸，10mm乙酸镁，100μg/mlbsa，ph 7.9。
17、作为本发明所述检测方法的一种优选方案，其中：所述1×缓冲液c的配方为：10mmtris-hcl，50mm nacl，10mm mgcl2，100μg/mlbsa，ph 7.9。
18、作为本发明所述检测方法的一种优选方案，其中：利用荧光分光光度计测量荧光信号时，设置激发波长为480nm，扫描范围为500-600nm。
19、本发明有益效果：
20、本发明公开了一种基于crispr-cas12a与杂交链式反应的妥布霉素检测系统，该检测系统中的识别探针可以与妥布霉素进行特异性结合并变构，触发杂交链式反应，产生可被crispr-cas12a系统识别的产物，激活lbcas12a蛋白-crrna复合体切割荧光报告探针，通过荧光强度分析，可实现对痕量妥布霉素的检测。该系统设计并优化了妥布霉素适配体序列在识别探针中的位置，提升了检测灵敏度。该系统将crispr-cas12a的部分激活序列设计在杂交链式反应元件h1的环区，有效提升信噪比。该方法检测灵敏度高，最低检测限为25pm，且能在牛奶及牛肉样本中检测妥布霉素，在食品安全及环境监测领域中具有广泛的应用前景。
1.一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测系统，其特征在于：包括，核酸探针tob-ap-5、信号扩增核酸元件h1、信号扩增核酸元件h2、lbcas12a蛋白、crrna、f-q报告探针；
2.如权利要求1所述的一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测方法，其特征在于：所述tob-ap-5探针序列如seq id no.1所示；h1序列如seq id no.2所示；h2序列如seq id no.3所示；crrna序列如seq id no.4；f-q报告探针序列如seq idno.5所示。
3.如权利要求1所述的基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测方法，其特征在于：所述识别探针tob-ap-5能够特异性识别妥布霉素，并诱发后续杂交链式反应。
4.如权利要求1所述的基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测方法，其特征在于：所述信号扩增核酸元件h1包含crispr-cas12a系统的识别序列，且该识别序列中的10个核苷酸存在与h1的环区。
5.一种基于crispr-cas12a及杂交链式反应的检测妥布霉素检测方法，其特征在于，所述检测方法为：
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述缓冲液a的配方为：25mm tris-hcl,500mm nacl，ph＝7.4。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述缓冲液b的配方为：50mm乙酸钾，20mm tris-乙酸，10mm乙酸镁，100μg/mlbsa，ph 7.9。
8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述1×缓冲液c的配方为：10mm tris-hcl，50mm nacl，10mm mgcl2，100μg/mlbsa，ph 7.9。
9.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：利用荧光分光光度计测量荧光信号时，设置激发波长为480nm，扫描范围为500-600nm。
