本发明涉及基因检测，特别是涉及一种感染病原微生物的多重pcr检测方法以及剂盒。
背景技术：
1、呼吸道感染是由各种病原微生物引起的常见疾病，包括细菌、病毒和真菌等。对呼吸道感染的病原微生物进行检测是诊断和治疗该类疾病的关键步骤之一。目前常见的呼吸道感染病原微生物检测技术包括传统的培养方法和分子生物学技术。而分子生物学技术则是一种快速、准确的检测方法，包括聚合酶链反应(pcr)、核酸杂交等。这些技术能够直接检测病原微生物的核酸序列，不需要进行培养，因此可以在较短的时间内得出结果。
2、mngs是一种新兴的高通量测序技术，能够同时检测样本中的所有微生物dna和rna，包括细菌、病毒、真菌和其他微生物。在呼吸道病原检测中，mngs技术已经得到了广泛的应用，并取得了一些重要的进展。首先，mngs技术能够快速、全面地检测呼吸道样本中的各种病原微生物。相比传统的培养和pcr技术，mngs不需要预先设定特定的病原微生物，而是能够检测样本中的全部微生物，包括那些难以培养或者未知的微生物。这使得mngs技术能够提供更全面的病原微生物信息，有助于对呼吸道感染的病因进行更准确的诊断。虽然mngs在临床样本的病原检测具有众多的优势，但其技术仍面临着一些挑战：1)临床样本中的人源核酸背景高，会干扰病原微生物的检出；2)对于胞内菌与真菌等微生物，其检测的灵敏性较低；3)检测成本较高。
技术实现思路
1、本发明提供一种用于检测呼吸道感染病原微生物的多重引物组与方法，能够精准覆盖可导致呼吸道感染的常见病原，靶向扩增目标序列，放大病原体的信号，具有较高的灵敏度与特异性，可实现病原体更为精准的广谱检测。
2、一种用于检测呼吸道感染病原微生物的引物组，包括有用于特性性扩增如下病原体的引物：包括用于同时特异性扩增如下病原体的引物：钩端螺旋体，洋葱伯克霍尔德菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，支气管败血鲍特菌，百日咳博德特氏菌，产气克雷伯菌，阴沟肠杆菌，产酸克雷伯菌，摩氏摩根菌，奇异变形杆菌，鼠疫耶尔森菌，副流感嗜血杆菌，伯氏考克斯氏体，普氏立克次氏体，恙虫病东方体，伤寒立克次氏体，沙眼衣原体，大芬戈尔德菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，化脓链球菌，炭疽芽孢杆菌，白喉杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，豚鼠耳炎诺卡菌，星状诺卡菌，人型支原体，肺炎支原体，解脲脲原体，微小根毛霉，克柔念珠菌，；组织胞浆菌，光滑念珠菌，热带念珠菌，皮炎外瓶霉，人疱疹病毒7，乙型肝炎病毒，鼻疽伯克霍尔德菌，类鼻疽伯克霍尔德菌，申克孢子丝菌，土曲霉。
3、具体的引物序列是具有如下核苷酸序列的或者具有相同功能的引物：
4、钩端螺旋体，seq id no.1-8；
5、洋葱伯克霍尔德菌，seq id no.9-16；
6、嗜肺军团菌，seq id no.17-24；
7、卡他莫拉菌，25-32；
8、支气管败血鲍特菌，33-42；
9、百日咳博德特氏菌，43-50；
10、产气克雷伯菌，51-58；
11、阴沟肠杆菌，59-66；
12、产酸克雷伯菌，67-76；
13、摩氏摩根菌，77-84；
14、奇异变形杆菌，85-92；
15、鼠疫耶尔森菌，93-100；
16、副流感嗜血杆菌，101-108；
17、伯氏考克斯氏体，109-116；
18、普氏立克次氏体，117-124；
19、恙虫病东方体，125-132；
20、伤寒立克次氏体，133-142；
21、沙眼衣原体，143-150；
22、大芬戈尔德菌，151-156；
23、表皮葡萄球菌，157-164；
24、溶血葡萄球菌，165-172；
25、人葡萄球菌，173-182；
26、化脓链球菌，183-190；
27、炭疽芽孢杆菌，191-200；
28、白喉杆菌，201-210；
29、鸟分枝杆菌，211-218；
30、胞内分枝杆菌，219-226；
31、堪萨斯分枝杆菌，227-234；
32、豚鼠耳炎诺卡菌，235-242；
33、星状诺卡菌，243-250；
34、人型支原体，251-260；
35、肺炎支原体，261-26；
36、解脲脲原体，269-278；
37、微小根毛霉，279-286；
38、克柔念珠菌，287-294；
39、组织胞浆菌，295-302；
40、光滑念珠菌，303-310；
41、热带念珠菌，311-318；
42、皮炎外瓶霉，319-326；
43、人疱疹病毒7，327-334；
44、乙型肝炎病毒，335-340；
45、鼻疽伯克霍尔德菌，341-348；
46、类鼻疽伯克霍尔德菌，349-356；
47、申克孢子丝菌，357-366；
48、土曲霉，367-374。
49、具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。
50、一种试剂盒，其中包含有上述的引物组。
51、上述的引物组在制备检测病原体试剂中的应用。
52、所述的应用包括如下步骤：
53、包括如下步骤：获得呼吸道感染相关样本，并采用上述的多重引物组进行多重pcr反应；反应产物经过末端修复、加a、加接头处理后，获得检测文库，并进行ngs测序。
54、所述的多重pcr反应中的反应体系包括：dna模板9μl，包含多重引物组的工作液6μl，hg multiplex pcr master mix 15μl，总体积30μl。
55、多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s；60℃退火2min；扩增40个循环；72℃延伸5min。
56、末端修复和加a步骤中，反应程序是：4℃下1min，20℃下15min，65℃下15min。
57、涉及的样本类型包括肺泡灌洗液、痰液、支气管分泌物等呼吸道样本。
58、有益效果
59、靶向宏基因组测序(targeted next-generation sequencing,tngs)是一种只针对某些特定病原的基因序列进行高通量测序的技术，将“pcr”和“ngs”两个技术的优势相结合，采用超多重pcr正向富集目标病原，在降低实验成本的基础上，能够对临床待测样本中几十种至几百种已知病原微生物进行检测且不受人源背景的干扰，可提高产品的时效性和灵敏度，
60、本发明的用于检测呼吸道感染病原微生物的方法，通过设计特定病原微生物基因片段的特异性引物，靶向扩增物种的目标序列，能够实现病原体的信号放大，有效降低背景核酸对于后续ngs检测结果的影响。该方法可操作性高，能够在同一个反应体系中一次性检测覆盖呼吸道感染的多种种常见病原，提高mngs对于肺泡灌洗液等样本中病原微生物的灵敏度和特异性，具有良好的应用价值。
1.一种用于检测呼吸道感染病原微生物的引物组，其特征在于，包括有用于特性性扩增如下病原体的引物：钩端螺旋体，洋葱伯克霍尔德菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，支气管败血鲍特菌，百日咳博德特氏菌，产气克雷伯菌，阴沟肠杆菌，产酸克雷伯菌，摩氏摩根菌，奇异变形杆菌，鼠疫耶尔森菌，副流感嗜血杆菌，伯氏考克斯氏体，普氏立克次氏体，恙虫病东方体，伤寒立克次氏体，沙眼衣原体，大芬戈尔德菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，化脓链球菌，炭疽芽孢杆菌，白喉杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，豚鼠耳炎诺卡菌，星状诺卡菌，人型支原体，肺炎支原体，解脲脲原体，微小根毛霉，克柔念珠菌，组织胞浆菌，光滑念珠菌，热带念珠菌，皮炎外瓶霉，人疱疹病毒7，乙型肝炎病毒，鼻疽伯克霍尔德菌，类鼻疽伯克霍尔德菌，申克孢子丝菌，土曲霉。
2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道感染病原微生物的引物组，其特征在于，具体的引物序列是具有如下核苷酸序列的或者具有相同功能的引物：
3.根据权利要求2所述的用于检测呼吸道感染病原微生物的引物组，其特征在于，具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。
4.一种试剂盒，其中包含有权利要求1所述的引物组。
5.权利要求1所述的引物组在制备检测病原体试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：获得呼吸道感染相关样本，并采用上述的多重引物组进行多重pcr反应；反应产物经过末端修复、加a、加接头处理后，获得检测文库，并进行ngs测序。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的多重pcr反应中的反应体系包括：dna模板9μl，包含多重引物组的工作液6μl，multiplex pcr master mix15μl，总体积30μl。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s；60℃退火2min；扩增40个循环；72℃延伸5min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，末端修复和加a步骤中，反应程序是：4℃下1min，20℃下15min，65℃下15min。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，涉及的样本类型包括肺泡灌洗液、痰液、支气管分泌物等呼吸道样本。
