本发明属于高分子药物合成，具体涉及诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物、制备方法和应用。
背景技术：
1、肿瘤免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,icd)是指肿瘤细胞在受到外界刺激后，通过宿主免疫反应的刺激，由非免疫原性状态转变为免疫原性状态。icd的典型免疫特征是损伤相关分子模式(damps)，如钙网蛋白(crt)、高迁移率族蛋白b1(hmgb1)、三磷酸腺苷(atp)的分泌和肿瘤相关抗原的释放，它们可促进树突状细胞(dc)成熟、迁移，将抗原呈递到t细胞后激活宿主免疫。而通过构建自身可直接诱导icd的纳米载体，一方面能够简化纳米平台组成，另一方面由于其自身的免疫功能能够有效的促进疗效，对于肿瘤的治疗具有重要意义。
2、原位肿瘤疫苗的抗原由体内正在死亡的肿瘤细胞直接释放，解决了肿瘤抗原异质性的问题。通过将免疫佐剂与肿瘤相关抗原(taas)结合，可促进原位肿瘤疫苗形成。该过程最明显的优点是不需要额外添加抗原，而依靠外部刺激后肿瘤自身产生抗原库，从而节省时间和成本。将crgd环肽修饰的纳米颗粒装载免疫佐剂(如雷西莫特r848)后，可选择性靶向细胞表面高表达αvβ3的肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞b16f10)，通过提高肿瘤细胞内在化促进原位癌症疫苗形成。
3、肿瘤微环境(tme)中的免疫抑制因子(如肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tams))极大地阻碍了免疫疗效。tams主要以免疫抑制性m2型存在，在肿瘤组织中占所有免疫细胞的50％，有助于肿瘤逃脱免疫监督。m1型tams具有促炎性，同时可通过将抗原呈递给t淋巴细胞来消除肿瘤。因此，利用极化剂(如r848)将m2-tams极化为m1型是通过调节tams重塑tme的方法之一。
4、甘露糖(mannose)修饰的纳米颗粒可靶向tams，通过增加胞内摄取提高极化率。此外，肿瘤细胞表面高表达分化簇47(cd47)，其可通过cd47/信号调节蛋白α(sirpα)参与肿瘤抵抗巨噬细胞吞噬。因此，tams极化和cd47/sirpα信号通路阻断在重塑tme中都是十分必要的。
5、因此，如何通过构建载体自身可诱导icd的聚合物纳米平台来简化平台组成，同时装载具有免疫佐剂功能及tams极化能力的药物，并在制剂表面分别修饰靶向肿瘤细胞、tams的靶向配体，用于在体内原位构建肿瘤疫苗、调节tme，实现双管齐下的目的，能够为时空协调天然与适应性免疫增强疗效提供新策略。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，该聚合物具有ph响应性，能够自组装得到聚合物纳米囊泡，并可装载药物。应用后能够诱导肿瘤icd形成原位肿瘤疫苗，并实现疏水性免疫佐剂的可控释放，极化肿瘤相关巨噬细胞(tams)，适于肿瘤免疫治疗应用。
2、本发明的第二目的在于提供上述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的制备方法。
3、本发明的第三目的在于提供上述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的应用。
4、本发明的第四目的在于提供一种抗肿瘤纳米药物，应用后能够诱导肿瘤icd形成原位肿瘤疫苗，并实现疏水性免疫佐剂的可控释放，极化肿瘤相关巨噬细胞(tams)，适于肿瘤免疫治疗应用。
5、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
6、一种诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的结构如式i所示：
7、
8、式i中，m为110～120的整数；n为70～75的整数；p为21～79的整数；
9、r为叔胺基团硫醚基团叔胺硫醚基团中的一种。
10、本发明提供的上述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，为a-b-c型嵌段聚合物。其中，嵌段a为聚乙二醇链段(peg)，对应的重复单元m为110～120的整数；嵌段b为聚甲基丙烯酸甲酯链段(pmma)，对应的重复单元n为70～75的整数；嵌段c为复合链段(p(ppma-mpa-dea))，对应的重复单元p为21～79的整数。本发明提供的该聚合物，具有新颖的化学结构，能够诱导肿瘤免疫原性细胞死亡(icd)，并且针对酸碱度(ph)具有响应性。其中，本发明聚合物在ph7.4条件下，疏水部分的分子量是亲水部分(嵌段a)的1.5倍及以上，非常适用于聚合物纳米囊泡的制备(双亲分子自组装的一种超分子聚集体)。并且，本发明聚合物中的ppma基团可通过接枝活性基团以引起肿瘤免疫原性细胞死亡。此外，将本发明的聚合物通过自组装制备得到聚合物纳米囊泡，进一步连接不同靶头后，可以实现对不同细胞的靶向，在囊泡的疏水内核中还可进一步包裹疏水药物免疫佐剂，从而不仅丰富了聚合物功能，还提升了药物的抗肿瘤效果。
11、为优化聚合物的免疫功能性结构和应用性能，作为优选的方案，m为114，n为73，p为79；r为叔胺硫醚基团
12、本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
13、诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的制备方法，包括以下步骤：
14、(1)将聚乙二醇-氨基与4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸n-琥珀酰亚胺酯进行酰胺化反应，得到聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酰胺，记为peg-cppa；
15、(2)将peg-cppa与甲基丙烯酸甲酯进行聚合反应，得到产物a，记为peg-pmma；
16、(3)将peg-pmma与n-炔丙基甲基丙烯酰胺进行反应，得到产物b，记为peg-pmma-pppma；
17、(4)将peg-pmma-pppma与巯基丙酸进行点击反应，得到产物e，记为peg-pmma-p(ppma-mpa)；
18、(5)将peg-pmma-p(ppma-mpa)与二乙氨基乙醇进行酯化反应，得到产物f，产物f即为所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，记为peg-pmma-p(ppma-mpa-dea)。
19、本发明的聚合物的制备方法，以peg-cpaa为链转移剂，通过活性raft聚合甲基丙烯酸甲酯单体，得到分子量可控、分子量分布较窄的聚合物。进一步通过活性raft聚合n-炔丙基甲基丙烯酰胺后，再和巯基丙酸发生点击反应后，与二乙氨基乙醇发生酯化反应，得到分子量可控、分子量分布较窄，能够诱导icd的聚合物。该过程的操作简单，工艺条件温和，易于实现聚合物的有效制备。
20、作为优选的方案，步骤(1)中，聚乙二醇-氨基与4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸n-琥珀酰亚胺酯的反应摩尔比为2∶3；步骤(2)中，peg-cppa与甲基丙烯酸甲酯的反应摩尔比为1∶100；步骤(3)中，peg-pmma与n-炔丙基甲基丙烯酰胺的反应摩尔比为1∶25；步骤(4)中，peg-pmma-pppma与巯基丙酸的反应摩尔比为1∶50；步骤(5)中，peg-pmma-p(ppma-mpa)与二乙氨基乙醇的反应摩尔比为1∶100。
21、本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
22、上述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的应用，在制备抗肿瘤纳米药物中的应用。
23、本发明的目的之四采用如下技术方案实现：
24、一种抗肿瘤纳米药物，所述抗肿瘤纳米药物的制备方法，包括以下步骤：将所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物进行自组装，得到聚合物纳米囊泡，再对聚合物纳米囊泡进行靶头修饰，并装载具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物，即得所述抗肿瘤纳米药物。
25、作为优选的方案，所述自组装的工艺过程为：将所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物溶于四氢呋喃中，然后加入磷酸盐缓冲液，通过溶剂交换法制备得到均匀分布的聚合物纳米囊泡。
26、作为优选的方案，所述靶头为甘露糖和/或crgd环肽。其中，crgd环肽，又名c(rgdfk)环肽。crgd环肽是一个五元环肽，由精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、d型苯丙氨酸、赖氨酸组成，并且首尾酰胺键成环，其是一种黑色素瘤靶向肽，与肿瘤细胞表面αvβ3受体结合，可作为某些类型癌症的肽靶向的工具。甘露糖为一种可靶向tams的活性物质，其通过增加胞内摄取提高极化率。
27、作为优选的方案，所述具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物为雷西莫特r848。
28、作为优选的方案，对聚合物纳米囊泡进行靶头修饰，并装载具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物，具体是：将聚合物纳米囊泡与带有靶头的聚合物、具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物混合均匀，然后通过溶剂置换法制备得到所述抗肿瘤纳米药物。进一步地，带有靶头的聚合物是将甘露糖和/或crgd环肽通过酯化反应连接到聚乙二醇的羧基端从而制备得到。
29、对于抗肿瘤纳米药物所作用的肿瘤细胞的种类，本发明不作特殊限定，具体应用时可进行不同的肿瘤细胞进行适应性设计。作为优选的方案，所述抗肿瘤纳米药物为抗黑色素瘤的药物。
30、本发明提供的抗肿瘤纳米药物，采用诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物制备得到。本发明制备的抗肿瘤纳米药物，为ph响应性纳米药物，可在ph7.4条件下，保持稳定性。进入细胞后，先进入溶酶体，从溶酶体逃逸后，靶向线粒体。纳米载体自身调节代谢氧化磷酸化和gsdmd上调焦亡直接诱导肿瘤icd。在ph5.0条件下，释放药物。其中，靶头修饰后靶向肿瘤细胞的纳米粒，释放的药物可作为免疫佐剂，激活dc细胞，形成原位肿瘤疫苗，激活t细胞。靶头修饰后靶向巨噬细胞的纳米粒，释放的药物可以极化巨噬细胞，激活免疫系统。黑色素瘤动物试验证实，本发明的抗肿瘤纳米药物使用后，可显著延长小鼠的生存中值，并导致明显的肿瘤细胞死亡。因此，本发明的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物以及制备的抗肿瘤纳米药物，能够有效应用于肿瘤免疫治疗，为利用免疫活性纳米材料在时空上协调适应性和先天免疫反应以有效治疗癌症提供新的治疗策略。
31、与现有技术相比，本发明的综合有益效果在于：
32、本发明提供的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，能够诱导多种肿瘤细胞免疫原性死亡，暴露肿瘤相关抗原，激活体内免疫反应。并且，聚合物通过自组装能够形成具有免疫活性的纳米粒，有效简化纳米平台。此外，本发明提供的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，可连接不同的靶头，实现对不同细胞的靶向，从而降低纳米药物对正常细胞以及免疫细胞的毒性，实现减毒增效。同时，本发明提供的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，通过自组装形成囊泡，囊泡的疏水内核可装载疏水药物。疏水药物可采用可极化巨噬细胞的免疫佐剂，从而使一种聚合物具有多种功能，非常适合肿瘤免疫治疗应用，在癌症免疫治疗尤其是黑色素瘤的免疫治疗方面具有广泛的应用价值。
1.一种诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，其特征在于，所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的结构如式i所示：
2.根据权利要求1所述的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物，其特征在于，m为114，n为73，p为79；r为叔胺硫醚基团
3.一种如权利要求1所述的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，聚乙二醇-氨基与4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸n-琥珀酰亚胺酯的反应摩尔比为2∶3；步骤(2)中，peg-cppa与甲基丙烯酸甲酯的反应摩尔比为1∶100；步骤(3)中，peg-pmma与n-炔丙基甲基丙烯酰胺的反应摩尔比为1∶25；步骤(4)中，peg-pmma-pppma与巯基丙酸的反应摩尔比为1∶50；步骤(5)中，peg-pmma-p(ppma-mpa)与二乙氨基乙醇的反应摩尔比为1∶100。
5.一种如权利要求1或2所述的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物的应用，其特征在于，在制备抗肿瘤纳米药物中的应用。
6.一种抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米药物的制备方法，包括以下步骤：将如权利要求1或2所述的诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物进行自组装，得到聚合物纳米囊泡，再对聚合物纳米囊泡进行靶头修饰，并装载具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物，即得所述抗肿瘤纳米药物。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述自组装的工艺过程为：将所述诱导肿瘤免疫原性细胞死亡的聚合物溶于四氢呋喃中，然后加入磷酸盐缓冲液，通过溶剂交换法制备得到均匀分布的聚合物纳米囊泡。
8.根据权利要求6所述的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述靶头为甘露糖和/或crgd环肽。
9.根据权利要求6所述的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述具有免疫佐剂功能与极化巨噬细胞功能的药物为雷西莫特r848。
10.根据权利要求6～9任一项所述的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米药物为抗黑色素瘤的药物。
