本发明属于分析检测，具体涉及一种同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法。
背景技术：
1、新烟碱类杀虫剂(neos)凭借其广谱、高效且低毒性的特点，在全世界范围内得到广泛应用。随着越来越多的研究发现新烟碱类物质残留在环境和生物体当中，人们开始逐渐重视新烟碱类物质的非靶标毒性。有些neos具有很强的持久性，由于反复使用，它们可以在环境中存留数年，并在周围环境中积累，从而产生长期风险。大量动物实验表明，长期暴露于新烟碱类物质，可能会抑制血清胆固醇生物合成、诱导间质细胞氧化应激、与性激素受体相互作用、减少参与睾酮产生的基因表达等不良效应。而部分新烟碱原物(p-neos)可在环境或生物体中发生转化，降解为毒性更大的代谢产物(m-neos)。人类可以通过摄入食物和饮用水以及吸入空气和粉尘等途径来接触新烟碱类物质，因此研究新烟碱类物质的人体暴露对于有效评估新烟碱类物质的危害有重大意义。
2、高效液相色谱串联质谱法(hplc-ms/ms)是目前进行neos分析研究的主要方法。由于采集样品的基质效应复杂，在测样前需对样品进行前处理。常用的前处理方法主要有固相萃取法(spe)、固相微萃取法(spme)、分散固相萃取法(dspe)、quechers(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)、液液萃取法(lle)和液液微萃取法(llme)等方法。而现有的neos的分析方法研究主要集中于食品(例如：水果、蔬菜、大米和蜂蜜等)和环境介质中(例如：水体、土壤、沉积物和空气等)，而在人体基质中(例如：尿液、血液、血清、毛发和母乳等)的研究则较少。尤其针对血液基质，由于含有大量的血细胞、磷脂、脂肪酸、甘油三酯、胆固醇及蛋白质，基质成分相较于其他人体基质(如尿液)而言更加复杂，基质干扰更为严重。
3、因此，亟需寻找一种能同时测定人体血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的快速定量分析方法。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，该方法可较大程度地去除血液基质的干扰，且消耗溶剂量少，对人体血液中14种新烟碱原物及其代谢产物可实现同时快速定量分析检测。
2、本发明的发明构思为：本发明针对血液样品中含有大量的血细胞、磷脂、脂肪酸、甘油三酯、胆固醇及蛋白质，基质成分复杂，干扰严重；而现有的预处理方法操作过程繁琐耗时，消耗溶剂量大，对于目标分析物的回收率低，难以满足对大量样品中的多种目标分析物的同步分析的需求的技术问题，提出了一种基于quechers方法的血液前处理方法，对血液样品进行加标、酶解、萃取、净化和复溶的预处理，并采用超高效液相色谱质谱(uhplc-ms/ms)联用方法进行检测，能够较好地去除血液的基质干扰，所需消耗的溶剂量较少，时间短；并可同时对人体血液中14种新烟碱原物及其代谢产物的进行同步快速定量分析。
3、为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，包括以下步骤：
4、(1)样品预处理：
5、①加标酶解：在含有新烟碱原物及其代谢产物的血液样品中加入内标化合物和酶解液，混合；
6、②萃取：在经步骤①处理的样品中加入乙腈，涡旋、离心，得萃取液；
7、③净化：在所述萃取液中加入吸附剂，涡旋，取上清液，吹干；
8、④复溶：对经步骤③处理的样品用甲醇复溶，过滤，得预处理样品；
9、(2)样品检测：
10、采用超高效液相色谱串联质谱对所述预处理样品进行分析，建立标准曲线，进行加标回收率检测。
11、优选地，所述新烟碱原物及其代谢产物包括啶虫脒(ace)、吡虫啉(imi)、噻虫胺(clo)、噻虫啉(thd)、噻虫嗪(thm)、呋虫胺(din)、烯啶虫胺(nit)、氟吡呋喃酮(flu)、氟啶虫胺腈(sul)、5-羟基吡虫啉(5-oh-imi)、n-去甲基啶虫脒(n-dm-ace)、脱硝基烯烃式吡虫啉(of--imi)、呋虫胺代谢物dn(din-g)和呋虫胺代谢物uf(din-u)中的至少一种。本发明的检测方法可使上述14种neos在一个样本的单次检测中完成，进行同步提取、检测和分析。
12、优选地，所述内标化合物包括ace-d3、imi-d4、clo-d3、thd-d4、thm-d3、din-d3、5-oh-imi-c13、n-dm-ace-c13、of-imi-c13中的至少一种。
13、进一步优选地，所述内标化合物为包含上述9种内标化合物的混合内标储备液。
14、优选地，所述内标化合物的浓度为80-120ng/ml。
15、优选地，所述酶解液包括β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶液。
16、优选地，所述吸附剂包括n-丙基乙二胺(psa)和石墨化碳黑(gcb)。
17、优选地，步骤①中，所述血液样品、内标化合物和酶解液的体积比为100：(5-15)：(10-30)。
18、优选地，步骤①中，所述混合采用先涡旋混匀，再在恒温摇床中进行酶解。
19、进一步优选地，所述酶解为在200-400r/min的转速下酶解10-15小时。
20、优选地，步骤②中，所述涡旋的时间为3-8min。
21、优选地，步骤②中，所述离心为在6000-10000r/min的转速下离心3-8min。
22、优选地，步骤③中，所述涡旋的时间为1-3min。
23、优选地，步骤④中，所述过滤为将混合相针式过滤器安装于无菌带针注射器的针筒与针头之间，将复溶液体通过针筒经针式过滤器进行过滤。
24、优选地，所述混合相针式过滤器的直径为13mm、孔径为0.22μm。
25、优选地，所述标准曲线的建立过程为：用含有新烟碱原物及其代谢产物的标准品与内标化合物的混合溶液配制浓度为0.01-50ng/ml的标准曲线样品，采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
26、优选地，所述超高效液相色谱采用的流动相包括流动a相和流动b相，所述流动a相包括甲酸水溶液，所述流动b相包括甲醇。
27、优选地，所述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱zorbax sb-c18柱，色谱柱的温度35-45℃，流速0.2-0.4ml/min，进样体积1-3μl。
28、优选地，所述超高效液相色谱采用梯度洗脱程序。
29、优选地，所述梯度洗脱程序如表1所示。
30、表1：
31、 时间(min) 流动a相(％) 流动b相(％) 0-3 90-99 1-10 3-6 60-70 30-40 6-9 40-50 50-60 9-10 60-70 30-40 10-12 90-99 1-10
32、优选地，所述质谱采用三重四极杆质谱。
33、优选地，所述质谱的条件为：正离子模式(esi+)；采集方式为多重反应监测(mrm)；毛细管电压为3-5kv；氮气为干燥气体，其压力为14-16psi，流速为12-14ml/min，温度为340-360℃。
34、本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
35、本发明通过对血液样品进行加标、酶解、萃取、净化和复溶的预处理，并采用uhplc-ms/ms联用方法进行检测，能够较好地去除血液的基质干扰，所需消耗的溶剂量较少，时间短；并可在一个样本的单次检测中完成人体血液中14种新烟碱原物及其代谢产物的快速定量分析，进行同步提取、检测和分析，样品平均回收率范围在60-120％之间，rsd小于20％，具有良好的准确性和可靠性。
1.一种同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述新烟碱原物及其代谢产物包括啶虫脒、吡虫啉、噻虫胺、噻虫啉、噻虫嗪、呋虫胺、烯啶虫胺、氟吡呋喃酮、氟啶虫胺腈、5-羟基吡虫啉、n-去甲基啶虫脒、脱硝基烯烃式吡虫啉、呋虫胺代谢物)、呋虫胺代谢物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述内标化合物包括ace-d3、imi-d4、clo-d3、thd-d4、thm-d3、din-d3、5-oh-imi-c13、n-dm-ace-c13、of-imi-c13中的至少一种。
4.根据权利要求1或3所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述内标化合物的浓度为80-120ng/ml。
5.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述酶解液包括β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶液。
6.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述吸附剂包括n-丙基乙二胺和石墨化碳黑。
7.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述标准曲线的建立过程为：用含有新烟碱原物及其代谢产物的标准品与内标化合物的混合溶液配制浓度为0.01-50ng/ml的标准曲线样品，采用超高效液相色谱串联质谱进行检测，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
8.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的流动相包括流动a相和流动b相，所述流动a相包括甲酸水溶液，所述流动b相包括甲醇。
9.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用梯度洗脱程序。
10.根据权利要求1所述的同时快速检测血液中多种新烟碱原物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述质谱采用三重四极杆质谱。
