本发明具体涉及基于crispr/cas12a的大白菜黑腐病检测方法及其相关材料和应用。
背景技术：
1、十字花科蔬菜黑腐病俗称“半边瘫”，危害十字花科多种蔬菜，大白菜黑腐病是一种细菌性维管束病害，以系统侵染为主。黑腐病菌在种子内和病残体上越冬，在白菜幼苗期即可发生，高温多雨和高湿多露条件，播期偏早以及水肥管理不当有利于病害的流行。白菜黑腐病病原菌为野油菜黄单胞杆菌野油菜黑腐病致病变种[xanthomonas campestrispv.campestris(pammel)dowson],属薄壁菌门、黄单孢杆菌属。病原菌菌体杆状，一端生单鞭毛，无芽孢，有荚膜，可链生。革兰氏染色反应阴性。它的发病症状为幼苗期感病后子叶呈水浸状，根髓部变黑而坏死，成株期一般从叶缘开始发病，形成“v”型褐色病斑，发病中后期病斑引起叶帮、叶球、根颈和花球腐烂，最终整株枯死。大白菜黑腐病是仅次于白菜“三大病害”的重要病害，严重威胁着白菜的产量和品质，病害的早期诊断是白菜病害防治中的重要环节，关于大白菜黑腐病菌的预防和诊断研究，前期已经报道了多种检测方法，包括荧光的免疫分析方法、重测序法、电子显微镜法以及荧光定量pcr法，然而这些检测方法对于大白菜病害的预防和诊断存在着一定的局限性，比如需要大型仪器设备、检测时间长、检测结果灵敏度低等。
技术实现思路
1、本发明解决的问题是如何鉴定大白菜黑腐病。
2、为了解决上述问题，本发明提供了rna分子。
3、所述rna分子为能与cas12a结合的向导rna分子，所述向导rna分子包括靶向区段和scaffold区段，所述靶向区段的核酸序列为序列1的第4位-第24位，所述scaffold区段的核酸序列为序列1的第25位-第44位。
4、所述向导rna分子中，scaffold区段位于5｀端，所述靶向区段位于3｀端。
5、本技术中，scaffold区段是本公开内容的cas12a grna(cas12a向导rna)的组分，其包含由cas12a蛋白识别的区段。scaffold区段可包含由cas12a蛋白识别的天然存在的茎环序列的核苷酸序列，或可包含形成由cas12a蛋白识别的区段的工程化核苷酸序列。参见，例如，zetsche等，2015,cell 163:759-771。
6、上文中，所述向导rna分子的核酸序列可为序列1的第4位-第44位。
7、上文中，所述向导rna分子的核酸序列还可为序列1。
8、为了解决上述问题，本发明还提供了生物材料。
9、所述生物材料包括下述任一种：
10、a1)、权利要求1所述rna分子的基因；
11、上述生物材料中，a1)所述基因中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的向导rna基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的向导rna基因的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要能产生本发明的向导rna，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
12、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
13、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
14、上述生物材料中，a2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述启动子可为t7启动子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。
15、上文中，a1)所述基因的核苷酸序列可为序列10的第26位-第66位。
16、上文中，a2)所述表达盒可的核苷酸序列可为序列10。
17、为了解决上述问题，本发明还提供了一种向导rna分子的制备方法。
18、所述向导rna分子为上述的向导rna分子，所述方法包括将上述的生物材料进行转录的步骤。
19、上文中，所述进行转录可为体外转录。所述体外转录可通过体外转录试剂盒完成。所述体外转录试剂盒可为neb公司的hiscribetmt7highyieldrna synthesis kit试剂盒体外。
20、上文中，所述制备方法还包括纯化的步骤。所述纯化的步骤了通过纯化试剂盒完成。所述纯化试剂盒可为公司的rnaclean&concentrator-25试剂盒。
21、为了解决上述问题，本发明还提供了一种检测大白菜黑腐病的试剂盒。
22、所述试剂盒包括上述述向导rna或按上述方法制备的向导rna分子和cas12a蛋白。
23、所述试剂盒中，所述向导rna分子和所述cas12a蛋白的物质量的比可为1:1。
24、所述试剂盒用于检测取自具有“v”型褐色病斑症状的大白菜的样品。
25、所述检测的位点可为叶片。
26、上述试剂盒中，所述试剂盒还包括检测探针，所述检测探针为ssdnaprobe 1或ssdnaprobe 2，所述ssdnaprobe 1为核苷酸序列是序列7的单链dna，所述ssdnaprobe 2为核苷酸序列是序列8的单链dna。
27、所述试剂盒中，所述向导rna分子、所述cas12a蛋白和所述检测探针的物质量的比可为1:1:10。
28、一种大白菜黑腐病的检测方法，包括将cas12a蛋白、上述向导rna分子、带荧光信号标记的报告dna和待测反应物，利用荧光报告基团的显色情况进行结果判定。
29、所述待测反应物可为pcr扩增产物。所述pcr扩增产物可为利用引物对rpa-black-its扩增的产物。所述带荧光信号标记的报告dna可为检测探针。所述检测探针可为ssdnaprobe 1或ssdnaprobe 2。
30、上文中，所述cas12a蛋白可为lba cas12a(cpf1)。
31、上文中，所述试剂盒还包括cas12a蛋白进行切割的体外试剂。cas12a蛋白进行切割的体外试剂可为nebuffer r2.1reaction buffer。
32、上文中，混合反应的反应体系中，cas12a蛋白浓度可为50nm。混合反应的反应体系中，cas12a蛋白浓度可为50nm。向导rna分子浓度可为50nm。检测探针浓度为500nm。待测样本扩增产物在总反应体系中的占比可为1/10。
33、引物对rpa-black-its，所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f序列为序列5，所述rpa-black-its-r序列为序列6。
34、上述试剂盒中，所述试剂盒还包括检测探针，所述检测探针为ssdnaprobe 3，所述ssdnaprobe 3为核苷酸序列是序列9的单链dna。
35、所述试剂盒中，所述向导rna分子、所述cas12a蛋白和所述检测探针的物质量的比可为1:1:10。
36、上述试剂盒中，所述试剂盒还包括检测大白菜黑腐病胶体金试纸，所述ssdnaprobe 3的一端标记有荧光素，另一端标记有生物素，所述试纸包括结合垫、检测线和质控线，所述结合垫包被有胶体金标记链霉亲和素，所述检测线包被有生物素标记的蛋白，所述质控线包被有荧光素抗体。
37、上文中，所述胶体金标记链霉亲和素胶体金直径可为15nm。
38、上文中，所述胶体金标记链霉亲和素购买于博奥森公司，货号bs-0437p-gold。
39、上文中，生物素标记的蛋白可为生物素标记的牛血清白蛋白。所述牛血清白蛋白可购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a600332-0100。
40、上文中，所述试纸的质控线处喷涂biotin/bsa。所述biotin/bsa又称生物素标记的bsa，购买于北京索莱宝科技有限公司，货号shb063-1ml。
41、所述生物素标记的蛋白可为生物素标记的载体蛋白。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白等可作为载体的蛋白质。
42、上文中，所述胶体金标记链霉亲和素包被体积为3μl。
43、上文中，物素标记的牛血清白蛋白包被浓度为0.5mg/ml。
44、上文中，荧光素抗体包被浓度为1mg/ml。
45、如上任一所述试剂盒，所述试剂盒还包括引物对rpa-black-its，所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f为核苷酸序列是序列5的单链dna，所述rpa-black-its-r为核苷酸序列是序列6的单链dna。
46、为了解决上述问题，本发明还提供了一种检测大白菜黑腐病病原菌的方法。
47、所述方法包括使用引物对rpa-black-its对待测样本的dna进行扩增，获得待测样本扩增产物，将cas12a蛋白、上述的rna分子、所述待测样本扩增产物和检测探针进行反应，通过检测所述检测探针的切割情况，来判断样本中是否含有大白菜黑腐病病原菌；所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f为核苷酸序列是序列5的单链dna，所述rpa-black-its-r为核苷酸序列是序列6的单链dna；
48、所述检测探针为ssdnaprobe 1或ssdnaprobe 2，所述ssdnaprobe 1为核苷酸序列是序列7的单链dna，所述ssdnaprobe 2为核苷酸序列是序列8的单链dna。
49、所述大白菜黑腐病病原菌为野油菜黄单胞杆菌野油菜黑腐病致病变种[xanthomonas campestris pv.campestris(pammel)dowson]。
50、所述待测样本可取自具有“v”型褐色病斑症状的大白菜的样品。所述样品可为叶片。
51、为了解决上述问题，本发明还提供了一种检测大白菜黑腐病胶体金试纸。
52、所述胶体金试纸为上述胶体金试纸。
53、一种大白菜黑腐病的检测方法，包括将cas12a蛋白、上述向导rna分子、带荧光信号标记的报告dna和待测反应物反应获得混合反应物，利用上述检测大白菜黑腐病胶体金试纸将混合反应物进行检测，根据试纸条显色情况进行结果判定。
54、所述待测反应物可为pcr扩增产物。所述pcr扩增产物可为利用引物对rpa-black-its扩增的产物。所述带荧光信号标记的报告dna可为检测探针。所述检测探针可为所述带荧光信号标记的报告dna可为ssdnaprobe 3。
55、若试纸条t检测线显色，试纸条c检测不显色，则待测反应物存在大白菜黑腐病菌。
56、若试纸条t检测线显色，试纸条c检测显色，则待测反应物存在大白菜黑腐病菌。
57、若试纸条t检测线不显色，试纸条c检测显色，则待测反应物不存在大白菜黑腐病菌。
58、若试纸条t检测线不显色，试纸条c检测不显色，则此次检测无效。
59、一种大白菜黑腐病的检测方法，所述方法包括使用引物对rpa-black-its对待测样本dna进行扩增，获得待测样本扩增产物，将cas12a蛋白、上述向导rna分子、待测样本扩增产物和检测探针(ssdnaprobe3)进行混合反应，使用上述检测大白菜黑腐病胶体金试纸对待测样本扩增产物进行检测，根据检测结果判断样本dna中是否含有大白菜黑腐病dna。
60、上文中，混合反应的反应体系中，cas12a蛋白浓度可为50nm。混合反应的反应体系中，cas12a蛋白浓度可为50nm。向导rna分子浓度可为50nm。检测探针浓度为500nm。待测样本扩增产物在总反应体系中的占比可为1/10。
61、引物对rpa-black-its，所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f序列为序列5，所述rpa-black-its-r序列为序列6。
62、上文中，所述检测大白菜黑腐病胶体金试纸的制备方法，所述方法包括检测线喷涂0.5mg/ml的biotin/bsa抗体，质控线喷涂1mg/ml的anti-fitc抗体，，胶体金垫喷涂含量为3μl的sa-aunps 3μl，组装试纸条，获得检测大白菜黑腐病胶体金试纸。
63、上述的rna分子、上述的生物材料、如上任一所述的试剂盒或上述的试纸在如下任一中的应用：
64、p1、在检测黑腐病中的应用；
65、p2、在制备检测检测黑腐病产品中的应用。
66、所述黑腐病为大白菜黑腐病。
67、由成簇的规则间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspacedshortpalindromic repeats,crispr)和相关蛋白(crispr-associatedprotein,cas)组成的crispr/cas系统是一种获得性适应性免疫系统，它广泛存在于古细菌和细菌中。其中2类v型的cas12a效应蛋白由一个crrna引导即可特异性识别靶标双链dna，在结合靶标dna的同时会激活cas12a的反式切割活性，对体系内存在的任意单链dna进行无差别切割，利用cas12a反式切割后的信号放大特性可以实现对核酸分子的检测。基于crispr/cas12a的检测系统已经被广泛应用于各种病菌的检测中，成功的实现了dna和rna的特异性快速检测。在这里，我们提出一个基于crispr/cas12a可视化的大白菜黑腐病检测方法以及在此基础上结合免疫层析试纸条的田间黑腐病检测方法，分别在35分钟内可以实现从dna的提取到可视化检测结果的获得，检测到黑腐病的最低浓度为0.0015ng/μl，在25分钟内同样可以实现从dna的提取到试纸条检测结果的获得，黑腐病最低检测线为0.0015ng/μl；最后我们以黑腐病实时荧光定量pcr检测方法为基准，分别比较了这三种黑腐病检测方法。
1.rna分子，其特征在于，所述rna分子为能与cas12a结合的向导rna分子，所述向导rna分子包括靶向区段和scaffold区段，所述靶向区段的核酸序列为序列1的第4位-第24位，所述scaffold区段的核酸序列为序列1的第25位-第44位。
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述任一种：
3.一种向导rna分子的制备方法，其特征在于，所述向导rna分子为权利要求1所述的向导rna分子，所述方法包括将权利要求2所述的生物材料进行转录的步骤。
4.一种检测大白菜黑腐病的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述向导rna或按权利要求3所述方法制备的向导rna分子和cas12a蛋白。
5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测探针，所述检测探针为ssdnaprobe 1或ssdnaprobe 2，所述ssdnaprobe 1为核苷酸序列是序列7的单链dna，所述ssdnaprobe 2为核苷酸序列是序列8的单链dna。
6.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测探针，所述检测探针为ssdnaprobe 3，所述ssdnaprobe 3为核苷酸序列是序列9的单链dna。
7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测大白菜黑腐病胶体金试纸，其特征在于，所述ssdnaprobe 3的一端标记有荧光素，另一端标记有生物素，所述试纸包括结合垫、检测线和质控线，所述结合垫包被有胶体金标记链霉亲和素，所述检测线包被有生物素标记的蛋白，所述质控线包被有荧光素抗体。
8.如权利要求4-7任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物对rpa-black-its，所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f为核苷酸序列是序列5的单链dna，所述rpa-black-its-r为核苷酸序列是序列6的单链dna。
9.一种检测大白菜黑腐病病原菌的方法，其特征在于，所述方法包括使用引物对rpa-black-its对待测样本的dna进行扩增，获得待测样本扩增产物，将cas12a蛋白、权利要求1所述的rna分子、所述待测样本扩增产物和检测探针进行反应，通过检测所述检测探针的切割情况，来判断样本中是否含有大白菜黑腐病病原菌；所述引物对rpa-black-its由rpa-black-its-f和rpa-black-its-r组成，所述rpa-black-its-f为核苷酸序列是序列5的单链dna，所述rpa-black-its-r为核苷酸序列是序列6的单链dna；
10.一种检测大白菜黑腐病胶体金试纸，其特征在于，所述胶体金试纸为权利要求7或8所述胶体金试纸。
11.权利要求1所述的rna分子、权利要求2所述的生物材料、权利要求4-8任一所述的试剂盒或权利要求10所述的试纸在如下任一中的应用：
