本发明涉及脂滴，具体涉及一种脂滴的收集和检测方法。
背景技术：
1、脂滴(lipid droplets,lds)是一种呈球状的细胞器，几乎存在于所有类型的生物体细胞内。与其他细胞器不同，脂滴的表面是单层的磷脂膜，且脂滴的大小受环境影响而动态变化。在哺乳动物细胞中，脂滴单分子膜的主要成分是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,pc)，高达60％，其次是磷脂酰、磷脂酰肌醇等。在磷脂膜上，有上千种不同的结构蛋白和功能蛋白定位于lds的表面，如dgat1、脂滴包被蛋白(perilipin)和rab蛋白等，调节lds内稳态和细胞内相互作用。脂滴的核心是中性脂质，如三酰甘油酯(triacylglycerols,tag)和甾醇酯(sterol esters,se)等。
2、目前认为细胞内的脂滴是细胞内脂质储存场所，避免过多的脂肪酸在细胞内堆积而损害膜的完整性。另外，脂滴还是重要的能量周转场所，通过和线粒体互作，能够快速给细胞提供能量。随着研究的深入，人们发现细胞内的脂滴具有比以往认为的更广泛的功能。例如，它们参与调节细胞中蛋白质和信号脂质的活化，充当脂肪酸运输的枢纽，被病毒用作组装平台等(welte ma.expanding roles for lipid droplets.curr biol.2015jun 1)。越来越多的证据表明细胞内的脂滴不单单是脂质储存的场所，尤其对于活化受到严格调控的免疫细胞来说。
3、目前对于脂滴在免疫细胞中的功能研究还十分不清楚，其中很大原因是受到脂滴精确检测方法的限制。对于细胞内脂滴通常可以通过探针或者荧光标记的方法精确测量脂滴含量和大小，但是对于溶液内的脂滴检测目前并没有合适的检测手段。因此急需开发一种简单直接的检测手段检测不同类型样品中脂滴的含量。
技术实现思路
1、本发明人通过前期的研究发现，免疫细胞在应激状态下细胞内能够积累大量的脂滴，并且部分脂滴可以被细胞分泌出去。同时分泌的脂滴能够作为细胞间信号传导的媒介，参与细胞之间活化。为此本申请提供一种新的免疫细胞外脂滴检测方法，可以更好的可视化观测细胞分泌的脂滴。
2、一方面，本发明提供一种脂滴的收集和检测方法，所述方法包括以下步骤：
3、s1：收集脂滴：将含脂滴的待测样品离心以获得含有脂滴的细胞培养上清；
4、s2：染色：向s1中得到的细胞培养上清中加入中性脂质染料得到染色混合物；
5、s3：涂片及观测：通过涂片的方法将染色后的脂滴封装于载玻片中并于荧光显微镜下拍照观测。
6、在具体实施方式中，在步骤s1中，所述含脂滴的待测样品为任何形式的含有脂滴的样品，例如其可以选自体外培养的含脂滴的细胞样品(如，2型固有淋巴细胞)、组织浸出液(如，腹腔灌洗液体和肺泡灌洗液)和血清，优选地，所述体外培养的含细胞的样品为体外培养的含免疫细胞的样品。
7、在具体实施方式中，对于细胞样品，所述步骤s1之前还包括用0.22μm滤器过滤细胞培养基。
8、在具体实施方式中，在步骤s1之前，使用100-500μl培养基重悬104-105个细胞并接种于细胞培养板中，细胞在培养箱环境(5％ co2,37℃)中培养1-3天。
9、在具体实施方式中，所述步骤s1进一步通过如下步骤进行：
10、s1-1：将含脂滴的待测样品在4-16℃条件下以300-500g转速离心5-10分钟，收集细胞培养上清1；以及
11、s1-2：将步骤s1-1中收集的细胞培养上清1在3000-5000g转速，4-16℃条件下离心10-30分钟去除细胞碎片，并收集细胞培养上清2。
12、在具体实施方式中，当待测样品为组织液、血清和肺泡灌洗液时，在步骤s1-2之后，还包括步骤s1-3：
13、将细胞培养上清2采用蔗糖密度梯度离心方法进一步纯化得到细胞培养上清3。步骤s1-3用于去除溶液中多余的杂质，获得更纯的脂滴。
14、在具体实施方式中，步骤s1-3包括：将步骤s1-2中收集的细胞培养上清2和60wt％蔗糖溶液混合成蔗糖终浓度为20wt％的混合液；通过加样针向离心管中加注5wt％的蔗糖溶液，随后将加样针插在离心管底部缓慢加注蔗糖终浓度为20wt％的上述混合液，最后在梯度的最上面一层覆盖ph 7.4的pbs缓冲液，其中，5wt％的蔗糖溶液、蔗糖终浓度为20wt％的上述混合液以及pbs缓冲液的体积比为5:5:1；在20000-200000g转速下离心30-120分钟，最后收集占所述离心管10vol％的最上层溶液为细胞培养上清3。
15、在具体实施方式中，在步骤s2中，所述中性脂质染料选自bodipy 493/503、hcslipidtoxtm。
16、在具体实施方式中，在步骤s2中，所述中性脂质染料的终浓度为10μm。
17、在具体实施方式中，在步骤s2中，向s1中得到的细胞培养上清中加入中性脂质染料得到染色混合物，并对其进行涡旋，于常温染色5-10分钟。
18、在具体实施方式中，在步骤s3中，涂片的方法包括：将染色混合液呈液滴状滴至干净的载玻片的中间，用一个干净的盖玻片与载玻片呈30°夹角一端缓齐，并缓慢降低盖玻片另一端，盖玻片接触载玻片中间位置染色混合液后使其自然缓慢贴合，待盖玻片和载玻片贴合，使用封片剂封住盖玻片和载玻片缝隙。
19、在具体实施方式中，在步骤s3中，使用zeiss lsm900激光共聚焦显微镜63x(na1.4)物镜分别在明场和488nm激光器下记录脂滴形态，并通过以下公式计算脂滴含量：
20、脂滴含量＝脂滴数量/起始液体体积。
21、有益效果
22、本发明提供一种新的脂滴收集和检测方法，其能够快速检测细胞外完整脂滴，并且无生物毒副作用，能够保持脂滴的生物活性。另外，本申请提供的方法还是一种可视化检测方法，能够直观记录脂滴大小和数量，为脂滴的观测和研究提供了一种实际可行的操作方法。
23、本申请首次在细胞外检测到脂滴的存在，此前并没有明确报道这种微型细胞器结构能够被分泌到细胞外面。本申请巧妙地借鉴细胞计数的方法在高倍镜显微镜下实现对脂滴地观测和计数。
1.一种脂滴的收集和检测方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s1中，所述含脂滴的待测样品为任何形式的含有脂滴的样品，例如其可以选自体外培养的含脂滴的细胞样品、组织浸出液和血清，优选地，所述体外培养的含细胞的样品为体外培养的含免疫细胞的样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s1之前，使用100-500μl培养基重悬104-105个细胞并接种于细胞培养板中，细胞在培养箱环境中培养1-3天。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤s1通过如下步骤进行：
5.根据权利要求4所述的方法，其中，当待测样品为组织液、血清和肺泡灌洗液时，在步骤s1-2之后，还包括步骤s1-3：
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤s1-3包括：将步骤s1-2中收集的细胞培养上清2和60wt％蔗糖溶液混合成蔗糖终浓度为20wt％的混合液；通过加样针向离心管中加注5wt％的蔗糖溶液，随后将加样针插在离心管底部缓慢加注蔗糖终浓度为20wt％的所述混合液，最后在梯度的最上面一层覆盖ph 7.4的pbs缓冲液，其中，5wt％的蔗糖溶液、蔗糖终浓度为20wt％的所述混合液以及pbs缓冲液的体积比为5:5:1；在20000-200000g转速下离心30-120分钟，最后收集占所述离心管10vol％的最上层溶液为细胞培养上清3。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s2中，
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s2中，向s1中得到的细胞培养上清中加入中性脂质染料得到染色混合物，并对其进行涡旋，于常温染色5-10分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s3中，涂片的方法包括：将染色混合液呈液滴状滴至干净的载玻片的中间，用一个干净的盖玻片与载玻片呈30°夹角一端缓齐，并缓慢降低盖玻片另一端，盖玻片接触载玻片中间位置染色混合液后使其自然缓慢贴合，待盖玻片和载玻片贴合，使用封片剂封住盖玻片和载玻片缝隙。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤s3中，使用zeiss lsm900激光共聚焦显微镜63x(na 1.4)物镜分别在明场和488nm激光器下记录脂滴形态，并通过以下公式计算脂滴含量：脂滴含量＝脂滴数量/起始液体体积。
