本发明属于微生物，具体涉及一株耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021及其应用。
背景技术：
1、海藻希瓦氏菌(shewanella alga)属于shewanella属，广泛分布于自然界尤其是海洋环境中，海藻希瓦氏菌是一种光合作用细菌，它通常与海藻共生，可以分解海藻中的有机物质，为海藻提供营养。同时，海藻希瓦氏菌也可以作为生物肥料和生物修复剂等应用，对于海洋生态系统的平衡和稳定具有重要的作用。但是，如果海藻希瓦氏菌的数量过多，就会消耗过多的氧气，导致海洋生态系统中的其他生物无法生存。它也是一类重要的人鱼共患病的条件性致病菌，给养殖渔业带来严重的经济损失。这种细菌能引起鱼类感染，其感染的报道也越来越多，同时对人类的健康危害极大，海藻希瓦菌可引起败血症，细菌性感染等。
2、目前，主要使用抗生素，控制水产养殖中的海藻希瓦菌，由于抗生素的不规范使用，细菌耐药性的现象越来越普遍。为响应国家减抗替抗的政策，需要找到可控制海藻希瓦菌的抗生素替代物，减少抗生素的使用，保护人类的健康和安全。
3、噬菌体是一种感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，形体极其微小，没有完整的细胞结构，由核酸与蛋白质构成，不能够脱离寄主而自行生长繁殖，因而一定要在活体细胞中生长。噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。一般一种细菌往往可以被多种噬菌体感染，但一种噬菌体只能感染一种细菌及与其相近的菌。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体，通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的肠道里，都可以找到噬菌体。
4、噬菌体治疗的优点主要包括：
5、①高度特异性：噬菌体对细菌的侵染具有高度特异性，不会杀灭目标菌以外的细菌，避免了广谱抗生素所导致的菌群失调类疾病的发生。
6、②清除目标菌后自动消失：噬菌体在体内清除目标菌后，由于失去宿主菌，不能继续复制，就会在机体内“自动消失”，不会发生积蓄中毒。
7、③不扰乱动物代谢：噬菌体只感染细菌，不会扰乱动物代谢，不引起动物感染性疾病，目前也尚未发现噬菌体治疗会带来严重的毒副作用。
8、④可以减少抗生素的使用：噬菌体疗法的应用可以减少抗生素的使用，为食品安全提供保障。
9、⑤可以识别特定病原细菌：噬菌体可以识别特定病原细菌，对环境影响小。
10、⑥可以利用宿主进行增殖并进入细菌体内：噬菌体可以利用宿主进行增殖，并进入细菌体内，高效裂解病原细菌。
11、因此，鉴于噬菌体治疗具有很多优点，是一种具有很大潜力的绿色生态技术，已广泛应用于临床医疗、畜牧业、水产养殖和种植业等领域。
12、通常情况下，大多数海藻希瓦氏菌噬菌体都不耐受高温，因为高温会破坏其蛋白质外壳和核酸结构，导致噬菌体失去感染活性。海藻希瓦氏菌噬菌体产品在生产过程中，有“喷粉”的环节过程，喷粉会造成噬菌体效价降低，影响噬菌体的性能。虽然少部分海藻希瓦氏菌噬菌体可以耐受短时高温，制粉，但是在保存过程中，经过1-3个月，效价会大幅度下滑。解决此问题，除了优化噬菌体保护剂之外，筛选耐高温、效价稳定、可长期保存的噬菌体至关重要。
技术实现思路
1、本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021及其应用。本发明提供的一株耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021，其对海藻希瓦氏菌有很强的裂解性和宽裂解谱，而且其在制备噬菌体粉剂的过程中耐高温，长期保存稳定性好，有利于工业化的生产制备噬菌体产品。
2、本发明上述目的通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本发明了一株海藻希瓦氏菌噬菌体(shewanella algaebacteriophage)pkp-sh23021，该噬菌体分离自福建漳州虾养殖场，该海藻希瓦氏菌噬菌体于2023年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45781。
4、电镜中观测到：噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约为62nm，有一个长约65nm的尾，颈部连着头部和尾部。根据病毒分类国际委员会(ictv)的分类标准鉴定，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。
5、第二方面，本发明提供了一种噬菌体组合物，所述噬菌体组合物包括上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021。
6、第三方面，本发明提供了如上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如上所述的所述的噬菌体组合物在制备用于防治海藻希瓦氏菌感染的疾病的药物、水产饲料添加剂、水体环境消毒剂或者用于处理鲜活或者冷冻水产品的生物抑菌剂的应用。本文中术语“防治”是指“预防和治疗”。“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。所述疾病包括由海藻希瓦氏菌感染引起的水产动物疾病等。例如，当水产动物如鱼类、虾类、贝类等受到海藻希瓦氏菌感染导致疾病时，海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021特异性地侵染海藻希瓦氏菌，通过裂解宿主细胞来降低其数量，从而预防或治疗由该菌引起的疾病，提高水产动物的生存率和生长性能。
7、第四方面，本发明提供了一种噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂的有效成分包括如上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如上所述的噬菌体组合物。优选的，所述噬菌体药物制剂还包括还包含药学上可接受的载体，其剂型为粉剂、溶液剂、乳剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。更优选的，所述噬菌体药物制剂的剂型为粉剂。本发明制备的噬菌体原液经喷雾干燥机喷粉，制成噬菌体粉剂后，效价仍可保持在108pfu/g，而且可以长期保存，保存3个月后，与初始噬菌体粉剂相比，基本保持不变。这说明该噬菌体不但可以耐短时高温，而且效价稳定，又可以长期保存。
8、所述噬菌体粉剂由噬菌体pkp-sh23021原液和辅料(淀粉、β-环状糊精、甘露醇)按照100∶5∶8∶3(v/m)的比例混合制备而成。该噬菌体粉剂长时间储存能维持一定的生物活性，如此延长了噬菌体产品的保质期；而且该噬菌体粉剂便于包装、运输和分发。
9、优选的，所述噬菌体药物制剂中噬菌体的效价为1×108pfu/g以上。
10、第五方面，本发明提供了一种水产饲料添加剂，所述水产饲料添加剂的有效成分包括如上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如上所述的噬菌体组合物。所述水产饲料添加剂中噬菌体的效价为1×108pfu/g以上。
11、第六方面，本发明提供一种水体环境消毒剂，所述水体环境消毒剂的有效成分包括如上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如上所述的噬菌体组合物。所述水体环境消毒剂中噬菌体的效价为1×108pfu/g以上。
12、第七方面，本发明提供了一种用于处理鲜活或者冷冻水产品的生物抑菌剂，所述生物抑菌剂的有效成分包括如上所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如上所述的噬菌体组合物。所述生物抑菌剂中噬菌体的效价为1×108pfu/g以上。在水产加工环节中，噬菌体pkp-sh23021可用于处理鲜活或冷冻水产品，以减少海藻希瓦氏菌致病菌的数量，降低食源性疾病的风险。
13、本发明的有益效果是：
14、1、本发明提供一株自行分离的海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021在噬菌体效价、最佳感染复数(moi)、最适生长温度、ph稳定性对噬菌体存活稳定性的影响等方面具有如下的生理特性和有益效果：(1)具有较高的效价，其效价可达1010pfu/ml；(2)最佳感染复数为0.01，对应最高效价为1010pfu/ml；(3)最适生长温度为30℃；(4)ph＝7时效价最高，且其效价在ph5-10的范围内都能维持在108-1010pfu/ml较高的水平。
15、2、本发明提供的海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021具有良好的耐高温特性，将其噬菌体原液置于60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中，水浴10min，60℃时效价1010pfu/ml；70℃时效价109pfu/ml，与原液相比仅降低一个数量级；80℃时效价108pfu/ml，与原液相比仅降低两个数量级；90℃时效价106pfu/ml，与原液相比仅降低四个数量级。
16、该耐高温特性使得海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021具有以下的优势：
17、(1)加工稳定性：在制备噬菌体产品时，如制备噬菌体粉剂时，即使喷粉温度高达80℃，该噬菌体还能保持生物活性，说明该噬菌体可以适应较高温度的工艺参数范围，有利于加工出稳定的噬菌体产品；
18、(2)储存、运输便利：对于长期储存的噬菌体产品，可以在更高的储存温度下保持稳定，而不必严格依赖低温冷冻，如此降低了储存成本，也提高了物流运输的便利性；
19、(3)环境适应性增强：在自然环境或者工业应用时，如用作水体环境消毒剂、用于处理鲜活或者冷冻水产品的生物抑菌剂时，环境温度可能会有所波动，但是该噬菌体可以在更广泛的温度范围内发挥作用；
20、(4)提升处理效率：在水产品加工、水产品消毒等环节，可能需要对物料进行高温处理以确保水产品的食品安全，而该噬菌体可以在高温的流程中依然保持有效，有助于杀灭该高温处理环节中的海藻希瓦氏菌。
21、3、本发明提供的海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021具有较强的裂解性和较宽的宿主范围，对100株不同的海藻希瓦氏菌毒株，可裂解其中的90株，裂解率达到90％。
22、4、本发明提供的海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021经喷雾干燥机喷粉，制成噬菌体粉剂后，效价仍可保持在108pfu/g。
23、5、本发明提供的海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021粉剂不但耐受短时高温，而且可以长期保存。
24、6、本发明提供的噬菌体从自然界获得，可以稳定遗传，适宜于大规模工业生产，而且使用安全，绿色环保。
1.一株耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021，其特征在于，该海藻希瓦氏菌噬菌体于2023年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45781。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物包括如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021。
3.如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备用于防治海藻希瓦氏菌感染的疾病的药物、水产饲料添加剂、水体环境消毒剂或者用于处理鲜活或者冷冻水产品的生物抑菌剂的应用。
4.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂的有效成分包括如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如权利要求2所述的噬菌体组合物。
5.如权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂还包括还包含药学上可接受的载体，其剂型为粉剂、溶液剂、乳剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
6.如权利要求5所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂的剂型为粉剂。
7.如权利要求6所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂中噬菌体的效价为1×108pfu/g以上。
8.一种水产饲料添加剂，其特征在于，所述水产饲料添加剂的有效成分包括如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如权利要求2所述的噬菌体组合物。
9.一种水体环境消毒剂，其特征在于，所述水体环境消毒剂的有效成分包括如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如权利要求2所述的噬菌体组合物。
10.一种用于处理鲜活或者冷冻水产品的生物抑菌剂，其特征在于，所述生物抑菌剂的有效成分包括如权利要求1所述的耐高温型海藻希瓦氏菌噬菌体pkp-sh23021或者如权利要求2所述的噬菌体组合物。
