本发明涉及生物医药，具体涉及一种多价猴痘病毒mrna疫苗及其制备方法与应用。
背景技术：
1、猴痘是由猴痘病毒(mpox virus，mpxv)感染引起的一种人畜共患传染性疾病。mpxv根据遗传差异分为两个不同的分支：分支i和分支ii，目前流行的是ii支系。1958年，mpxv首次在丹麦实验室的食蟹猴中发现并命名，可引起人类猴痘，其症状像天花。mpxv通过接触受感染动物的呼吸道分泌物、血液和其他体液传播，或通过受感染动物的咬伤或抓伤传播，潜伏期一般为6-13天。在人类中，猴痘的典型临床表现包括高烧、头痛和肌痛、淋巴结肿大以及从面部、舌头和口腔开始发烧后出现皮疹，然后扩散到全身。该病通常比天花病情轻，但可导致死亡，死亡率高达10％。流行病学显示，mpxv最初是在中非和西非国家周围发现的，但自2022年以来，猴痘在非流行性国家出现了大规模的流行和暴发。截止2023年7月25日，在113个国家和地区，确诊病例超过88 600例，死亡病例152例。世界卫生组织(worldhealth organization，who)宣布2022年猴痘疫情为国际关注的突发公共卫生事件。猴痘疫情的暴发对人类生命和健康、社会稳定和经济发展产生重大影响。
2、mpxv属痘病毒科(poxviridae)正痘病毒属(orthopoxvirus)。除mpxv外，该属还有三种可感染人致病的病毒，包括天花病毒(variola virus，varv)、猴痘病毒(mpxv)、牛痘病毒(cowpox virus，cpxv)和痘苗病毒(vaccinia virus，vacv)。已有研究表明，正痘病毒免疫反应能够提供交叉保护。mpxv基因组与varv高度相似。由于抗原的相似性，天花疫苗对mpxv有效。据报道，在20世纪80年代非洲猴痘疫情暴发期间，天花疫苗作为一种减毒活疫苗，对猴痘的保护率约为85％，但可引起副作用。猴痘在世界范围内传播迅速，目前还没有临床审批通过的特异性的mpxv疫苗，因此开发安全、高效的预防性疫苗是猴痘病毒控制的趋势。
3、mrna疫苗在预防传染病和治疗肿瘤等许多医学领域具有不可估量的潜在应用价值。它是一种通过体外转录技术合成编码抗原的mrna，并通过递送系统转运到特定组织和细胞的疫苗。mrna疫苗由宿主细胞自身翻译系统翻译，同时诱导体液免疫和细胞免疫，可以通过多种机制有效保护机体。与其他类型的疫苗相比，mrna疫苗更容易设计和生产。例如，辉瑞/biontech的mrna疫苗bnt162b2和moderna的mrna-1273都是针对sars-cov-2冠状病毒(covid-19)表面刺突蛋白设计，结果表明，两种疫苗的保护力均大于94.0％。筛选mpxv的最佳靶抗原是mrna序列设计的关键，这将在很大程度上决定疫苗的有效性和保护效果。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种mpxv mrna疫苗，只需一条mrna即可产生很好的免疫保护效果，且安全性良好，具有工业化生产简单，质量控制容易等特点，是mpxv疫苗的理想选择。
2、本发明的技术方案是提供一种通过接头-(g4s1)3将mpxv的4个抗原蛋白(b6r、a35r、a29l和m1r)串联在一起表达的mpxv mrna疫苗，在小鼠体内，经体液免疫和细胞免疫，以及攻毒保护效果评价和安全性评价等实验显示，该疫苗具有良好的免疫原性，可以保护小鼠免受痘病毒的感染，且安全性良好。
3、具体来说，本发明提供以下技术方案：
4、一方面，本发明提供多价猴痘病毒mrna疫苗，其特征在于，所述疫苗经柔性接头串联共表达猴痘病毒的多个抗原蛋白而获得。
5、在一些实施方案中，所述多个抗原蛋白选自b6r、a35r、a29l和m1r。
6、在一些实施方案中，所述b6r的编码序列包含seq id no:1所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成。
7、在一些实施方案中，所述a35r的编码序列包含seq id no:2所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成。
8、在一些实施方案中，所述a29l的编码序列包含seq id no:3所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成。
9、在一些实施方案中，所述m1r的编码序列包含seq id no:4所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成。
10、在一些实施方案中，所述b6r的氨基酸序列包含seq id no:6所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
11、在一些实施方案中，所述a35r的氨基酸序列包含seq id no:7所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
12、在一些实施方案中，所述a29l的氨基酸序列包含seq id no:8所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
13、在一些实施方案中，所述m1r的氨基酸序列包含seq id no:9所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
14、在一些实施方案，所述柔性接头包含甘氨酸和丝氨酸，优选地，所述柔性接头的氨基酸序列为ggggsggggsggggs。
15、在一些实施方案中，所述mrna疫苗的编码序列包括b6r的编码序列+柔性接头的编码序列+a35r的编码序列+柔性接头的编码序列+a29l的编码序列+柔性接头的编码序列+m1r的编码序列。
16、在一些实施方案中，所述mrna疫苗的编码序列还包括5'utr和3'utr序列，并在5'端加cap修饰和3'端加poly(a)。
17、在一些实施方案中，所述5'utr的核苷酸序列如seq id no:11所示。
18、在一些实施方案中，所述3'utr的核苷酸序列如seq id no:12所示。
19、在一些实施方案中，所述mrna的编码序列如seq id no:5所示。
20、在一些实施方案中，所述mrna的氨基酸序列如seq id no:10所示。
21、另一方面，本发明提供mrna疫苗脂质复合物，所述脂质包括可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。
22、在一些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质为阳离子脂质sm-102。
23、在一些实施方案中，所述磷脂为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)。
24、在一些实施方案中，所述聚乙二醇化脂质为dmg-peg 2000。
25、另一方面，本发明提供药物组合物，其包括如上所述的疫苗和药学上可接受的载体。
26、另一方面，本发明提供制备mrna疫苗脂质复合物的方法，其包括：
27、a.将可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质溶解在无水乙醇中，得到有机相；
28、b.将如上所述的mrna疫苗溶解在柠檬酸缓冲液中，得到水相；
29、c.将有机相溶液和水相溶液混合，即获得mrna疫苗脂质复合物。
30、另一方面，本发明提供如上所述的mrna疫苗在制备用于预防和/或治疗猴痘病毒感染的药物中的应用。
31、另一方面，本发明提供预防和/或治疗猴痘病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用如上所述的mrna疫苗。
32、在本发明中，氨基酸残基用以下简写符号记载：丙氨酸(ala或a)，精氨酸(arg或r)，天冬酰胺(asn或n)，天冬氨酸(asp或d)，半胱氨酸(cys或c)，谷氨酰胺(gln或q)，谷氨酸(glu或e)，甘氨酸(gly或g)，组氨酸(his或h)，异亮氨酸(ile或i)，亮氨酸(leu或l)，赖氨酸(lys或k)，甲硫氨酸(met或m)，苯丙氨酸(phe或f)，脯氨酸(pro或p)，丝氨酸(ser或s)，苏氨酸(thr或t)，色氨酸(trp或w)，酪氨酸(tyr或y)，缬氨酸(val或v)，以及任意的氨基酸残基(xaa或x)。此外，在本发明中，氨基酸序列是以氨基末端(也称为n末端)位于左侧，羧基末端(也称为c末端)位于右侧的方式来描述。
33、在本发明中，保守氨基酸突变通过用在具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组内的另一种氨基酸取代氨基酸序列中的一种氨基酸进行。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环族氨基酸。脂肪族氨基酸包括1)含一氨基一羧基的中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)含羟基氨基酸：丝氨酸和苏氨酸；3)含硫氨基酸：半胱氨酸和甲硫氨酸；4)含酰胺基氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺：5)含一氨基二羧基的酸性氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸；6)含二氨基一羧基的碱性氨基酸：赖氨酸和精氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸和酪氨酸。杂环族氨基酸包括色氨酸、组氨酸和脯氨酸。
34、定义(请结合本发明对以下术语定义)
35、b6r：mpxv表面一个中和抗体的作用靶点。
36、a35r：mpxv表面一个中和抗体的作用靶点。
37、a29l：mpxv表面一个中和抗体的作用靶点。
38、m1r：mpxv表面一个中和抗体的作用靶点。
39、prnt50：50％血清空斑减少中和实验(50％plaque reduction neutralizingtest，prnt50)，用于评价病毒对抗能力。
40、lnp：lipid nanoparticles，脂质纳米颗粒，一种mrna递送系统，其中至少包含一种脂质。
41、mrna疫苗：mrna是一种天然存在的分子，带有人类细胞的“蓝图”，可以产生靶标蛋白或免疫原，激活体内免疫反应，以对抗各种病原体。mrna疫苗利用的是病毒的基因序列而不是病毒本身，因此，mrna疫苗不带有病毒成分，没有感染风险。
42、有益结果
43、本发明的研究表明，经柔性接头串联共表达mpxv 4个抗原蛋白b6r、a35r、a29l和m1r的mrna疫苗，经免疫小鼠后，可产生良好的体液免疫和细胞免疫，保护小鼠免受痘病毒感染，且安全性良好。体外经激光共聚焦和流式细胞技术检测，结果显示，a29l蛋白经串联共表达后，可与其他三个蛋白b6r、a35r和m1r一起表达在细胞膜表面。体内实验结果显示，与单独表达mpxv 4个蛋白组或四个蛋白混合组相比，1103mrna免疫组具有更强的体液免疫和细胞免疫作用，可保护小鼠免受痘苗病毒感染，且安全性良好。与已有文献报道的mpxvmrna疫苗，如多抗原片段分别表达的单mrna混合疫苗、多抗原经串联后分别表达的单条疫苗等比，具有生产工艺简单、生产成本低和免疫效果好等优点。因此，本发明提供的mpxvmrna疫苗，更适用于临床应用，具有潜在的新药开发价值。
44、本发明首次提出通过mpxv 4个抗原蛋白b6r、a35r、a29l和m1r经柔性接头串联共表达在细胞膜上的抗原设计方式，将4个抗原的核酸序列制备成一条mrna序列，经脂质体包裹后制备成mpxv mrna疫苗。该疫苗经免疫小鼠后产生良好的体液免疫和细胞免疫，可保护小鼠免受痘病毒疫苗株感染，且安全性良好。而现有mpxv mrna疫苗多为多条表达不同抗原蛋白的mrna序列混合而成，增加了质量控制难度，同时，提高了生产成本。有文献报道将表达不同抗原蛋白的核酸序列串联成一条mrna序列，但各抗原蛋白为分开表达，多次免疫小鼠后部分抗原蛋白仍未检测到抗体产生。而本发明对mpxv 4个抗原蛋白b6r、a35r、a29l和m1r进行创新设计，不仅4个抗原蛋白碱基序列在一条mrna上，且4个蛋白融合表达，由该条mrna序列制备成的mpxv疫苗可以在小鼠体内产生良好的免疫效果，保护小鼠免受痘病毒感染，且安全性良好，具有潜在的新药开发价值。
45、此外，本发明选择的是猴痘病毒4个抗原蛋白(b6r、a35r、a29l和m1r)的全长序列，核酸序列经串联后4个蛋白融合表达，而一些现有技术例如cn116036259a选择的是猴痘病毒抗原m1、h3、a29、a35、b6和e8的抗原蛋白核酸序列分别制备成mrna，等比例混合后经脂质纳米颗粒包裹制备成的猴痘病毒多抗原mrna疫苗，与本发明不同。
1.多价猴痘病毒mrna疫苗，其特征在于，所述疫苗经柔性接头串联共表达猴痘病毒的多个抗原蛋白而获得，所述多个抗原蛋白选自b6r、a35r、a29l和m1r。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述b6r的编码序列包含seq id no:1所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成，任选地所述b6r的氨基酸序列包含seq id no:6所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述a35r的编码序列包含seq id no:2所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成，任选地所述a35r的氨基酸序列包含seq id no:7所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述a29l的编码序列包含seqid no:3所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成，任选地所述a29l的氨基酸序列包含seq id no:8所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述m1r的编码序列包含seqid no:4所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)核苷酸突变(优选置换、插入或缺失)的核苷酸序列，或由其组成，任选地所述m1r的氨基酸序列包含seq id no:9所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述柔性接头包含甘氨酸和丝氨酸，优选地，所述柔性接头的氨基酸序列为ggggsggggsggggs。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述mrna疫苗的编码序列还包括5'utr和3'utr序列，并在5'端加cap修饰和3'端加poly(a)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述5'utr的核苷酸序列如seqid no:11所示，所述3'utr的核苷酸序列如seq id no:12所示。
9.药物组合物，其包括根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗猴痘病毒感染的药物中的应用。
