本技术涉及使用两个或更多个色谱柱进行的蛋白质分离和纯化的领域。
背景技术：
1、治疗性蛋白质(特别是单克隆抗体(mab))经受各种翻译后修饰(ptm)，如氧化、脱酰胺、糖基化和赖氨酸截短。这些修饰中的一些产生蛋白质电荷变体。需要对治疗性蛋白质的电荷变体进行表征和分析以确保药物产品的质量不受影响。然而，大规模的蛋白质纯化和分离可能是昂贵的并且耗时的。分离特定蛋白质种类(species)的传统方法依赖于hplc和/或fplc，所述方法可花费数周至数月以产生大量产物用于进一步分析和/或使用。传统方法典型地强制决定了具有高生产率或高纯度，但两者通常不能同时实现。
2、因此，在蛋白质纯化领域中仍然需要用于使产率和纯度最大化同时减少产生纯化样品所需时间的方法。
技术实现思路
1、本公开文本的一些方面涉及从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。
2、本公开文本的一些方面涉及从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。
3、本公开文本的一些方面涉及用于富集用于分析表征的蛋白质种类的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)使来自(a)的所述种类经受分析表征。
4、本公开文本的一些方面涉及用于进行蛋白质种类的分析表征的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)对来自(a)的所述种类进行分析表征。
5、在一些方面，所述分析表征通过以下进行：hplc系统、毛细管等电聚焦(cief)凝胶电泳、成像毛细管等电聚焦(icief)、阳离子交换色谱法(cex)、阴离子交换色谱法(aex)、mfi、sec-mals、sec或质谱法。在一些方面，与hplc或fplc相比，所述方法产生所述蛋白质种类的增加的纯度和/或增加的产率。
6、在一些方面，所述两个或更多个色谱柱富集所述种类。
7、在一些方面，所述方法进一步包括将所述混合物加载到所述第一色谱柱上。在一些方面，所述加载的混合物通过所述第一色谱柱并且被分离成包含所述种类的富集种类和丢弃种类(“富集阶段i”)。在一些方面，所述富集种类通过所述第二柱，并且将所述丢弃种类在所述第一色谱柱后丢弃(“富集阶段ii”)。
8、在一些方面，所述方法进一步包括重新平衡所述第一色谱柱。
9、在一些方面，所述方法进一步包括使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。在一些方面，所述方法进一步包括将另外的混合物加载到所述第一柱中，其中所述另外的混合物包含所述种类和一种或多种杂质。在一些方面，在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中的同时添加所述另外的混合物。在一些方面，在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中之后并且在所述富集种类通过所述第一色谱柱之前添加所述另外的混合物。
10、在一些方面，所述富集阶段i和ii重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。
11、在一些方面，所述方法进一步包括耗尽阶段。在一些方面，所述耗尽阶段包括在不存在另外的混合物的情况下使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。在一些方面，所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第一色谱柱并且将所述种类与一种或多种杂质分离。在一些方面，所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第二色谱柱，将所述种类与一种或多种杂质分离。
12、在一些方面，所述方法进一步包括洗脱所述种类。在一些方面，所述方法产生至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的所述蛋白质种类。
13、在一些方面，所洗脱的所述种类的浓度是所述混合物中所述种类的浓度的至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。
14、在一些方面，所述色谱柱中的一个或多个包括盐梯度、ph梯度或两者。在一些方面，所述盐梯度包括氯化钠梯度。在一些方面，所述盐梯度包括有或没有盐。在一些方面，所述盐的浓度在约50mm与约600mm之间、在约100mm与约550mm之间、在约150mm与约500mm之间、在约200mm与约450mm之间、在约250mm与约400mm之间、在约100mm与约400mm之间、在约100mm与约350mm之间、在约100mm与约300mm之间、在约100mm与约250mm之间、在约300mm与约600mm之间、在约350mm与约550mm之间、在约400mm与约500mm之间或在约350mm与约450mm之间。在一些方面，所述盐的浓度为至少50mm、至少约100mm、至少约150mm、至少约200mm、至少约250mm、至少约260mm、至少约270mm、至少约280mm、至少约290mm、至少约300mm、至少约310mm、至少约320mm、至少约330mm、至少约340mm、至少约350mm、至少约360mm、至少约370mm、至少约380mm、至少约390mm、至少约400mm、至少约450mm、至少约500mm、至少约550mm或至少约600mm。
15、在一些方面，所述ph梯度的ph在约ph 3与约ph 11之间。在一些方面，所述混合物在缓冲液中。在一些方面，所述缓冲液包括mes、磷酸盐缓冲液、tris或其任何组合。
16、在一些方面，所述方法进一步包括测量翻译后修饰。在一些方面，所述翻译后修饰包括n-谷氨酰胺焦谷氨酸化、c末端赖氨酸截短、c末端脯氨酸酰胺化、糖化、唾液酸化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、通用截短或其任何组合。
17、在一些方面，所述蛋白质包括融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分结合选自以下的抗原：pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tigit、gitr、cxcr4、cd73、her2、vegf、cd20、cd40、cd11a、组织因子(tf)、mica/b psca、il-8、egfr、her3、her4及其任何组合。
18、在一些方面，所述融合蛋白包含免疫球蛋白组分和生长因子。在一些方面，所述融合蛋白包括fc融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包括与ctla-4融合的fc。在一些方面，所述融合蛋白包含阿巴西普或贝拉西普。
19、在一些方面，所述融合蛋白包括与白介素融合的fc。
20、在一些方面，所述融合蛋白或抗体的种类是酸性种类、碱性种类或主要种类。在一些方面，通过蛋白a亲和色谱法部分地纯化所述融合蛋白或抗体。
21、在一些方面，通过逆流纯化系统富集所述种类。在一些方面，所述逆流纯化系统是多柱逆流溶剂梯度纯化(mcsgp)系统。
22、本公开文本的一些方面涉及通过本文公开的方法制备的蛋白质种类。在一些方面，所述蛋白质种类是电荷变体。
23、本公开文本的一些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文公开的所述蛋白质种类。
1.一种从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。
2.一种从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。
3.一种用于富集用于分析表征的蛋白质种类的方法，所述方法包括：
4.一种用于进行蛋白质种类的分析表征的方法，所述方法包括：
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述分析表征通过以下进行：hplc系统、毛细管等电聚焦(cief)凝胶电泳、成像毛细管等电聚焦(icief)、阳离子交换色谱法(cex)、阴离子交换色谱法(aex)、mfi、sec-mals、sec或质谱法。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，与hplc或fplc相比，所述方法产生所述蛋白质种类的增加的纯度和/或增加的产率。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个色谱柱富集所述种类。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括将所述混合物加载到所述第一色谱柱上。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述加载的混合物通过所述第一色谱柱并且被分离成包含所述种类的富集种类和丢弃种类(“富集阶段i”)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述富集种类通过第二柱，并且将所述丢弃种类在所述第一色谱柱后丢弃(“富集阶段ii”)。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括重新平衡所述第一色谱柱。
12.根据权利要求10或11所述的方法，所述方法进一步包括使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将另外的混合物加载到所述第一柱中，其中所述另外的混合物包含所述种类和一种或多种杂质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中的同时添加所述另外的混合物。
15.根据权利要求13所述的方法，其中在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中之后并且在所述富集种类通过所述第一色谱柱之前添加所述另外的混合物。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述富集阶段i和ii重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括耗尽阶段。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述耗尽阶段包括在不存在另外的混合物的情况下使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第一色谱柱并且将所述种类与一种或多种杂质分离。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第二色谱柱，将所述种类与一种或多种杂质分离。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括洗脱所述种类。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法产生至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的所述蛋白质种类。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所洗脱的所述种类的浓度是所述混合物中所述种类的浓度的至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述色谱柱中的一个或多个包括盐梯度、ph梯度或两者。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述盐梯度包括氯化钠梯度。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述盐梯度包括有或没有盐。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度在约50mm与约600mm之间、在约100mm与约550mm之间、在约150mm与约500mm之间、在约200mm与约450mm之间、在约250mm与约400mm之间、在约100mm与约400mm之间、在约100mm与约350mm之间、在约100mm与约300mm之间、在约100mm与约250mm之间、在约300mm与约600mm之间、在约350mm与约550mm之间、在约400mm与约500mm之间或在约350mm与约450mm之间。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度为至少50mm、至少约100mm、至少约150mm、至少约200mm、至少约250mm、至少约260mm、至少约270mm、至少约280mm、至少约290mm、至少约300mm、至少约310mm、至少约320mm、至少约330mm、至少约340mm、至少约350mm、至少约360mm、至少约370mm、至少约380mm、至少约390mm、至少约400mm、至少约450mm、至少约500mm、至少约550mm或至少约600mm。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述ph梯度的ph在约ph 3与约ph11之间。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述混合物在缓冲液中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述缓冲液包括mes、磷酸盐缓冲液、tris或其任何组合。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测量翻译后修饰。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述翻译后修饰包括n-谷氨酰胺焦谷氨酸化、c末端赖氨酸截短、c末端脯氨酸酰胺化、糖化、唾液酸化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、通用截短或其任何组合。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包括融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分结合选自以下的抗原：pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tigit、gitr、cxcr4、cd73、her2、vegf、cd20、cd40、cd11a、组织因子(tf)、mica/b psca、il-8、egfr、her3、her4及其任何组合。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述融合蛋白包含免疫球蛋白组分和生长因子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白包括fc融合蛋白。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述融合蛋白包括与ctla-4融合的fc。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包括阿巴西普或贝拉西普。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述融合蛋白包括与白介素融合的fc。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或抗体的种类是酸性种类、碱性种类或主要种类。
42.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中通过蛋白a亲和色谱法部分地纯化所述融合蛋白或抗体。
43.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过逆流纯化系统富集所述种类。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述逆流纯化系统是多柱逆流溶剂梯度纯化(mcsgp)系统。
45.一种通过根据权利要求1至44中任一项所述的方法制备的蛋白质种类。
46.根据权利要求45所述的蛋白质种类，其是电荷变体。
47.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求45或46所述的蛋白质种类。
