本发明涉及经修饰的重组集聚蛋白(agrin)或其片段和重组嵌合层粘连蛋白-巢蛋白或其片段，编码这些蛋白质的核酸序列，包含这些核酸序列的载体，包含这些蛋白质的组合物，以及这些蛋白质在预防和/或治疗先天性肌营养不良症、特别是(层粘连蛋白-α2)lama2相关肌营养不良症中的用途。
背景技术：
1、细胞外基质(ecm)通过提供固相细胞粘附底物来稳定细胞和组织，最终将ecm与细胞的细胞骨架连接起来。ecm连接丢失的后果在遗传性肌营养不良症中尤为明显。不同层粘连蛋白中的突变会导致严重的疾病，这是由ecm-受体-细胞骨架连接中断造成的。编码这些蛋白质的基因中的突变会导致肌营养不良症，这支持了以下观点：从ecm到细胞骨架的横向连接的中断会导致肌膜(sarcolemmal)稳定性和肌肉功能的障碍。
2、层粘连蛋白-211(α2β1γ1链组成；缩写为lm-211)在成人肌肉和周围神经中表达。位于人染色体6q2上的编码层粘连蛋白-211的α2链的lama2基因(mim 156225)内的突变(helbling-leclerc a,et al.(1995)-mutations in the laminin-α2chain gene(lama2)cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy.nat genet 11:216-218)会导致先天性肌营养不良症(cmd)的一种特殊亚型，其特征是早发性并且通常非常严重(c.jimenez-mallebrera,s.c.brown,c.a.sewry,f.muntoni.congenital musculardystrophy:molecular and cellular aspects,cell.mol.life sci.62(7–8)(2005)809–823)。所谓的lama2(先天性)肌营养不良症(或lama2 md或lama2 cmd，以前也称为mdc1a)是cmd中最大的亚组。例如，在最近对英国249名cmd患者的研究中，93名患者(37.4％)携带lama2突变(sgframeli et al.,congenital muscular dystrophies in the ukpopulation:clinical and molecular spectrum of a large cohort diagnosed overa12-year period.neuromuscul disord 27(2017)793-803)。突变遍布整个lama2基因，其中大多数是无义突变，导致蛋白质过早截短，从而引起严重的不能行走的营养不良症(yurchenco pd,mckee kk,reinhard jr and rüegg ma.laminin-deficient musculardystrophy:molecular pathogenesis and structural repair strategies.matrixbiology,2018；https://doi.org/10.1016/j.matbio.2017.11.009)。具有此类突变的患者在肌肉活检中缺乏任何层粘连蛋白-α2染色，但表达的β1和γ1层粘连蛋白链的量与健康对照者类似。诊断需要基因确认。
3、如mercuri e,c,muntoni f(mercuri e,cg,muntonif.muscular dystrophies.lancet 2019；394:2025–38)总结的，lama2 md先天性肌营养不良症的临床表现在出生后的头几天或几周内就已经很明显。患病儿童表现为全身肌张力低下(婴儿松弛综合征)和血液中肌酐激酶水平的急剧升高。其他特征包括经常无法独立坐、站或走，以及发育不良，这可能是因为吞咽所需的肌肉无力。通常情况下，认知功能是正常的，但大约20％的患者会出现白质特征性变化并发生癫痫。心脏受累也很少见。得到最佳护理的患者通常可以活到成年早期。
4、最近的研究评估了ecm分子集聚蛋白的部分的微型化设计版本在转基因过度表达的层粘连蛋白-α2缺陷小鼠中的作用。结果表明，这种“微型集聚蛋白(mini-agrin)”(缩写为“mag”)功能性地替代了细胞表面受体α-肌营养不良蛋白聚糖和细胞外层粘连蛋白网络之间缺失的连接。这种人工“微型集聚蛋白”的表达显著延长了层粘连蛋白α2缺陷小鼠的寿命，改善了运动能力和肌肉组织学(j.moll,p.barzaghi,s.lin,g.bezakova,h.lochmüller,e.engvall,u.müller,m.a.ruegg.an agrin minigene rescues dystrophicsymptoms in a mouse model for congenital muscular dystrophy.nature.2001sep20；413(6853):302-7.)。尽管这种策略具有益处，至少在lama2 md动物模型中得到证实，但肌营养不良症在表达mag的lama2缺陷小鼠中仍然会进展，并且预期寿命仍明显短于野生型对照。其他出版物已显示转基因表达微型集聚蛋白具有有益作用(reinhard jr,lin s,mckee kk,meinen s,stephanie sc,sury m,hobbs s,maier g,yurchenco pd,rüegg ma；2017.linker proteins restore basement membrane and correct lama2-relatedmuscular dystrophy in mice.sci.transl.med.9,eaal4649)。然而，在引用的出版物中，在lama2 md的dyw/dyw小鼠模型中表达的核酸序列产生的微型集聚蛋白版本在蛋白质印迹中显示为两条带，表观相对分子量分别为80和110kda(图6)。较高分子量的带对应于全长微型集聚蛋白，而较低分子量的带是蛋白水解切割的结果，表明全长微型集聚蛋白的蛋白质降解。这种蛋白质降解可能会严重限制微型集聚蛋白的潜在治疗用途。
5、us2003/0224981教导了一种治疗哺乳动物中的lama2 md的方法，包括施用包含至少一个层粘连蛋白结合结构域和至少一个α-肌营养不良蛋白聚糖结合结构域的蛋白质或上调内源性集聚蛋白的物质。使用上调内源性集聚蛋白的物质可能会引起毒性，因为已证明，仅在运动神经元中表达的集聚蛋白的特定剪接变体可导致神经肌肉接头不稳定(lins,maj m,bezakova g,magyar jp,brenner hr,ruegg ma(2008)muscle-wide secretionof a miniaturized form of neural agrin rescues focal neuromuscularinnervation in agrin mutant mice.proc natl acad sci u s a 105:11406-11411)。
6、因此，仍然需要找到适合在人中达到治疗目标的蛋白质/核酸序列，尤其是稳定且可以有效安全地转移到受lama2 md影响的人患者体内的构建体。
7、本发明的目的是提供用于治疗先天性肌肉疾病、特别是(层粘连蛋白-α2)lama2相关肌营养不良症的生物分子和/或组合物。
技术实现思路
1、本发明提供了一种经修饰的重组集聚蛋白或其片段，特别是微型集聚蛋白，以及重组嵌合层粘连蛋白-巢蛋白或其片段，特别是αlnnd蛋白，编码这些蛋白的核酸序列，包含这些核酸序列的载体，以及包含这些蛋白、核酸序列和载体的组合物。
2、本发明还提供了所述蛋白质、编码所述蛋白质的核酸序列、包含所述核酸序列的载体以及包含所述蛋白质、核酸序列和载体的组合物用于预防和/或治疗先天性肌营养不良症。
3、本技术的发明人出乎意料地发现，重组集聚蛋白或其片段能够抵抗蛋白质切割和降解，所述，重组集聚蛋白或其片段至少包含层粘连蛋白球状结构域3(lg3结构域)以及连接egf样结构域4(eg4结构域)与lg3结构域的氨基酸序列，其中重组集聚蛋白或其片段的连接eg4结构域与lg3结构域的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基是经修饰的。
1.一种重组集聚蛋白或其片段，其中，其片段至少包含所述重组集聚蛋白的n端集聚蛋白结构域(nta结构域)、层粘连蛋白球状结构域2(lg2结构域)、层粘连蛋白球状结构域3(lg3结构域)以及连接egf样结构域4(eg4结构域)与所述lg3结构域的氨基酸序列，并且其中，所述重组集聚蛋白或其片段的连接所述eg4结构域与所述lg3结构域的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基是经修饰的，其中，所述重组集聚蛋白的连接所述eg4结构域与所述lg3结构域的氨基酸序列包含如seq id no:65所示的氨基酸序列kglveasagd。
2.根据权利要求1所述的重组集聚蛋白或其片段，其中，所述重组集聚蛋白或其片段的连接所述eg4结构域与所述lg3结构域的氨基酸序列的至少一个经修饰的氨基酸残基为如seq id no:65所示的氨基酸序列kglveasagd的e与s之间的a。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组集聚蛋白或其片段，其中，所述重组集聚蛋白的片段还包含以下多肽：信号序列(ss)、卵泡抑素样结构域(fs结构域)、三个egf样结构域(eg结构域)和一个层粘连蛋白球状结构域(lg结构域)。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的重组集聚蛋白或其片段，其中，所述重组集聚蛋白的所述片段包含以下多肽：信号序列(ss)、n端集聚蛋白结构域(nta结构域)、卵泡抑素样结构域(fs结构域)、egf样结构域1(eg1结构域)、层粘连蛋白球状结构域1(lg1结构域)、egf样结构域2(eg2结构域)、egf样结构域3(eg3结构域)、层粘连蛋白球状结构域2(lg2结构域)、egf样结构域4(eg4结构域)、层粘连蛋白球状结构域3(lg3结构域)以及连接所述egf样结构域4(eg4结构域)与所述lg3结构域的氨基酸序列，其中，所述片段的连接所述eg4结构域与所述lg3结构域的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基是经修饰的，其中，所述重组集聚蛋白的连接所述eg4结构域与所述lg3结构域的氨基酸序列包含如seq id no:65所示的氨基酸序列kglveasagd。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的集聚蛋白或其片段，其中，所述集聚蛋白或其片段包含如seq id no:11所示的序列。
6.一种编码根据权利要求1至5中任一项所述的集聚蛋白或其片段的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的核酸序列，其中，所述核酸序列还包含与编码集聚蛋白或其片段的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性启动子。
8.一种包含根据权利要求6或权利要求7所述的核酸序列的载体。
9.一种包含如seq id no:39所示的序列或包含如seq id no:68所示的序列的重组嵌合层粘连蛋白-巢蛋白或其片段。
10.一种编码根据权利要求9所述的蛋白的核酸序列。
11.根据权利要求10所述的核酸序列，其中，所述核酸序列还包含与编码根据权利要求9所述的蛋白的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性启动子或普遍存在的启动子。
12.一种包含根据权利要求10或权利要求11所述的核酸序列的载体。
13.一种组合物，其包含：
14.根据权利要求1至5中任一项所述的集聚蛋白或其片段和/或根据权利要求9所述的重组嵌合层粘连蛋白-巢蛋白或其片段、或者根据权利要求6或7所述的核酸序列和/或根据权利要求10或11所述的核酸序列、或者根据权利要求8所述的载体和/或根据权利要求12所述的载体、或者包含根据权利要求6或7所述的核酸序列和根据权利要求10或11所述的核酸序列的载体、和/或根据权利要求13的所述组合物用于预防和/或治疗先天性肌营养不良症。
15.根据权利要求14所述使用的蛋白质、核酸序列、载体或组合物，其中，所述先天性肌营养不良症为(层粘连蛋白-α2)lama2相关肌营养不良症。
16.根据权利要求14或15所述使用的蛋白质、核酸序列、载体或组合物，其中，用于表达重组层粘连蛋白-巢蛋白的aav载体和用于表达集聚蛋白或其片段的aav载体与免疫抑制剂或奥米加匹(n-(二苯并(b,f)氧杂环庚烯-10-基甲基)-n-甲基-n-丙-2-炔基胺)组合使用。
