本公开总体上涉及，以用于细胞活力和从外源大dna质粒的转基因表达的不同增强子方法的新型组合方法，增强细胞活力和从大dna质粒到细胞(如ips细胞)中的转基因表达的方法。
背景技术：
1、电穿孔是将组合物引入到细胞中的已知的方法。术语电穿孔、电转染和电加载(electroloading)已经在文献中可互换使用，其中强调该技术的一般含义。电穿孔可以是例如流式电穿孔或静态电穿孔。用于电穿孔的方法和装置还描述于例如公开的pct申请号wo 03/018751和wo 2004/031353；u.s.专利申请系列号10/781,440、10/080,272和10/675,592；和u.s.专利号5,720,921、6,074605、6,773,669、6,090,617、6,485,961、6,617,154、5,612,207，其每一篇均通过引用并入本文。
2、电穿孔可以损伤细胞，这导致电穿孔后细胞活力的降低。现有技术没有描述当试图转染大质粒如dna时改善细胞活力和表达的电穿孔方法或系统。本发明呈现了增加细胞活力的电穿孔细胞的方法。
3、本公开寻求通过可以应用于其他细胞类型和应用的方法来克服前述缺陷，以改善细胞工程化的效率，无论该细胞工程化与蛋白质生产还是细胞疗法相关。因此，描述了用于完成细胞工程化的新方法以改善细胞活力和非常难以转染的大dna质粒的表达。
4、所公开的方法寻求通过增强细胞活力和从大dna质粒到细胞(如ips细胞)中的转基因表达来克服现有技术的一个或多个问题。因此，描述了具有适当dna浓度的平衡电穿孔方案，其允许细胞通过添加增强子来存活。已经表明，如果dna毒性太大并且电穿孔能量太高，则增强子没有作用。
5、发明概述
6、在一个实施方案中，公开了用细胞培养进行电穿孔的方法，其包括以下步骤：a)将细胞与抗凋亡蛋白(如基因bcl-xl的mrna形式)共电穿孔；b)将dnase添加至处于温度t1，如高于37℃的电穿孔细胞；和c)在电穿孔后将细胞的温度降低至温度t2，如32℃或以下。
7、在一个实施方案中，描述了在ipsc中共电穿孔bcl-xl mrna与dna质粒的方法。如本文所用，ips细胞是指“诱导多能干细胞”。这些是衍生自成体体细胞的多能干细胞类型，其通过对维持es细胞的定义性特性重要的基因和因子的强制表达而被遗传重编程为胚胎干(es)细胞样状态。
8、在一个实施方案中，描述了对电穿孔方案的修饰以实现本文所述的有益特性。此类修饰包括但不限于添加bcl-xl mrna以改善细胞活力和增强转基因表达。一个或多个所述修饰导致增加的细胞稳定性。这需要在较高的效率和较少的细胞与较低的效率和较高的细胞数量之间的平衡。
9、在一个实施方案中，描述了电穿孔后修饰似乎增强了转基因表达，电穿孔后修饰包括但不限于：电穿孔后添加dnase增强了细胞活力；和冷休克(如48小时)。
10、在一个实施方案中，该方法进一步包括添加作为dna质粒与dnase一起递送的基因编辑工具。可以用于本文的基因编辑工具的非限制性实例包括基于crispr-cas9的prime编辑或碱基编辑器。
11、在一个实施方案中，以每20ul体积1单位dnase的量添加dnase。
12、将温度转换至较低温度减少了递送的货物的降解并且减少了细胞增殖，这确保了来自递送至细胞中的载体的转基因的更高表达。
13、在一个实施方案中，在ipsc中将bcl-xl mrna与dna质粒共电穿孔后，可以将dnase添加至电穿孔细胞，并且随后回收以允许膜回收。最后，所公开的方法包括热处理步骤，其通常包括在将温度升高至约37℃之前,将温度降低至如32℃，持续一段期望的时间，如24-48小时。
14、还描述了通过所公开的方法制备的包含至少一种添加材料的电穿孔细胞。所公开的电穿孔细胞包含增强选自细胞活力和转基因表达的至少一个特性的添加材料。
技术实现思路
1.用细胞培养进行电穿孔的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养包括解离细胞。
3.权利要求1所述的方法，其中所述抗凋亡蛋白是基因bcl-xl的mrna形式。
4.权利要求3所述的方法，其中所述bcl-xl是质粒形式。
5.权利要求1所述的方法，其中所述抗凋亡蛋白是基因bcl2的mrna形式。
6.权利要求5所述的方法，其中所述bcl2是质粒形式。
7.权利要求1所述的方法，其中细胞类型选自由ipsc、pbmc、b细胞、hek293细胞和cho细胞组成的组。
8.权利要求1所述的方法，其进一步包括添加作为dna质粒与所述dnase一起递送的基因编辑工具。
9.权利要求8所述的方法，其中所述基因编辑工具是基于crispr-cas9的prime编辑或碱基编辑器。
10.权利要求1所述的方法，其中每20ul体积添加1单位的dnase。
11.权利要求1所述的方法，其中温度t1是37℃以上。
12.权利要求1所述的方法，其中温度t2是32℃或以下。
13.权利要求12所述的方法，其中所述温度在t2保持范围为30-40分钟的时间段。
14.电穿孔细胞，其包含至少一种添加的材料，所述添加的材料增强选自细胞活力和转基因表达的至少一种特性，其中所述电穿孔细胞通过权利要求1所述的方法制备。
