本技术属于分子生物学领域，涉及基因检测，具体的是涉及一种用于检测肝癌的系统。
背景技术：
1、肝癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤疾病。导致肝癌高死亡率的重要因素是早期肝癌的确诊率低。早期肝癌的治愈率远高于中晚期，但是由于早期肝癌缺乏明显和特异的症状，绝大部分患者确诊时已经发展进入中晚期。临床研究发现，癌症从病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要数年时间；这为发现早期肝癌、提高早期肝癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率。
2、近年的研究显示表观遗传学在癌症的发生、发展中起着重要作用。作为表观遗传学的一种重要机制，多种癌症的dna甲基化调控得到了深入研究。研究数据显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。但是目前缺乏针对肝癌甲基化基因检测的检测技术、方法和产品。因此，当前对用于肝癌检测的敏感性高和特异性高的甲基化基因标记物存在需求。
3、其中，rnf135基因(homo sapiens ring finger protein 135)，是含无名指结构域的e3泛素连接酶，参与基因转录、翻译、细胞粘附、上皮发育的调节和在细胞周期调节。ring finger protein 135(rnf135)由n端环指结构域和c端spry和pry基序15组成，属于含无名指蛋白家族e3泛素连接酶，位于染色体17q11.2。该基因在病毒感染早期泛素化rig-i并促进其信号转导从而产生干扰素-β。这一过程在发育和疾病发病机制的广泛生物学过程中起着非常重要的作用。研究表明，rnf135基因在恶性周围神经鞘膜肿瘤的雪旺细胞中下调，而rnf135表达下调可引起u87和u251胶质瘤细胞erk通路失活(erk通路参与细胞周期进程、细胞生长、增殖和迁移的调节)，从而抑制细胞生长和迁移。
4、chfr基因(checkpoint with forkhead and ring finger domains)，是一种有丝分裂应激检查点基因，已被克隆并定位于染色体12q24.33。在暴露于破坏微管结构的药物(例如诺考达唑或紫杉醇)的哺乳动物细胞中，chfr蛋白介导了进入中期的延迟。其在显微镜下的特征是染色体浓缩延迟，细胞周期进程被延迟，直到细胞损伤得到修复。此外，chfr促进细胞存活以响应有丝分裂应激。
5、pax5基因(paired box protein 5)，是进化上高度保守的一个基因，可编码b细胞特异性激活蛋白(b cell-specific activator protein，bsap)。研究已证明，b细胞分化与发育是一个有序的动态转录调控过程。在b细胞的分化发育在免疫调节及免疫应答中起到重要作用。转录因子影响着b细胞的定向分化发育过程。特别是转录因子pax5起到关键的调控作用。
技术实现思路
1、目前临床上应用于早期肝癌诊断和筛查的技术主要为影像学检测技术，包括：x-光胸片和低剂量螺旋ct(ld-ct)。大规模临床数据分析发现，x-光胸片检查对于降低肝癌死亡率方面的作用不显著；ld-ct对于降低肝癌死亡率方面的作用显著，但是存在极高的假阳性率(90％)，因此存在过度诊断导致过度治疗的风险。此外，影像学检查在设备成本、操作技术、和放射性等方面上的限制，也难以作为肝癌筛查技术而大范围推广。
2、而传统血清肿瘤标识物(如：cyfra21-scc、cea等)检测对肝癌检测的灵敏度较低，尤其是早期肝癌的检测，无法充分满足早癌筛查的要求。
3、基于现有肝癌检测中存在的问题，本技术的目的在于提供一种用于检测肝癌的系统和方法。
4、本技术具体技术方案如下：
5、1.一种检测肝癌的系统，其中所述系统包括：
6、数据采集模块，其用于获取受试者样本的甲基化标志物水平的数据；以及
7、患肝癌概率的计算模块，其用于对数据采集模块中的获取的数据进行计算，从而计算出受试者患肝癌的概率，
8、其中所述甲基化标志物为rnf135基因、chfr基因和pax5基因中的一种、两种或三种。
9、2.根据项1所述的系统，其中所述rnf135基因的靶序列如seq id no:1或seq idno:2或seq id no:3或seq id no:4所示。
10、3.根据项1所述的系统，其中所述chfr基因的靶序列如seq id no:5或seq id no:6或seq id no:7或seq id no:8所示。
11、4.根据项1所述的系统，其中所述pax5基因的靶序列如seq id no:9或seq id no:10或seq id no:11或seq id no:12所示。
12、5.根据项1-4中任一项所述的系统，其中所述数据采集模块包括以下子模块：
13、提取模块，其用于提取样本的基因组dna；
14、试剂处理模块，其用于使用亚硫酸氢盐试剂处理提取的基因组dna，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
15、检测模块，其用于对亚硫酸氢盐试剂处理的基因组dna进行检测，以获得样本的甲基化标志物水平。
16、6.根据项5所述的系统，其中使用实时荧光定量pcr对亚硫酸氢盐试剂处理的基因组dna进行检测。
17、7.根据项6所述的系统，其中所使用的引物为seq id no:13和seq id no:14的序列，或者其为seq id no:16和seq id no:17的序列，或者其为seq id no:19和seq id no:20的序列。
18、8.根据项6所述的系统，其中所使用的探针为seq id no:15的序列，或seq id no:18的序列，或seq id no:21的序列。
19、9.根据项1-8中任一项所述的系统，其中在所述患肝癌概率的计算模块中，预先存储有预先构建的基于甲基化标志物水平的数据拟合的用于计算受试者患肝癌概率的公式。
20、10.根据项9所述的系统，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平的数据拟合得到的。
21、11.根据项9或10所述的系统，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平的数据拟合得到的。
22、12.根据项9-11中任一项所述的系统，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平、chfr的甲基化水平的数据拟合得到的。
23、13.根据项9-12中任一项所述的系统，其中所述公式是将现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平、chfr的甲基化水平的数据利用广义线性回归拟合得到的。
24、14.根据项9-13中任一项所述的系统，其中所述公式为：
25、p＝e(a*m1+b*m2+c*m3+81)/(e(a*m1+b*m2+c*m3+81)+1)，
26、其中p表示受试者患肝癌概率，m1表示rnf135通过实时荧光定量pcr测定的ct值，m2表示pax5通过实时荧光定量pcr测定的ct值，m3表示chfr通过实时荧光定量pcr测定的ct值，
27、a选自0.8-1.2中的任意数值，优选为0.9；
28、b选自0.6-0.9中的任意数值，优选为0.7；
29、c选自0.1-0.5中的任意数值，优选为0.3。
30、15.根据项1-14中任一项所述的系统，其中当受试者患肝癌的概率大于等于0.24时，判定受试者患有肝癌。
31、16.根据项1-15中任一项所述的系统，其中所述样本为包括：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
32、17.一种检测肝癌的方法，其中所述方法包括：
33、数据采集步骤，其获取受试者样本的甲基化标志物水平的数据；以及
34、患肝癌概率的计算步骤，其对数据采集步骤中的获取的数据进行计算，从而计算出受试者患肝癌的概率，
35、其中所述甲基化标志物为rnf135基因、chfr基因和pax5基因中的一种、两种或三种。
36、18.根据项17所述的方法，其中所述rnf135基因的靶序列如seq id no:1或seq idno:2或seq id no:3或seq id no:4所示。
37、19.根据项17所述的方法，其中所述chfr基因的靶序列如seq id no:5或seq idno:6或seq id no:7或seq id no:8所示。
38、20.根据项17所述的方法，其中所述pax5基因的靶序列如seq id no:9或seq idno:10或seq id no:11或seq id no:12所示。
39、21.根据项17-20中任一项所述的方法，其中所述数据采集步骤包括以下子步骤：
40、提取步骤，其提取样本的基因组dna；
41、试剂处理步骤，其使用亚硫酸氢盐试剂处理提取的基因组dna，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
42、检测步骤，其对亚硫酸氢盐试剂处理的基因组dna进行检测，以获得样本的甲基化标志物水平。
43、22.根据项21所述的方法，其中使用实时荧光定量pcr对亚硫酸氢盐试剂处理的基因组dna进行检测。
44、23.根据项22所述的方法，其中所使用的引物为seq id no:13和seq id no:14的序列，或者其为seq id no:16和seq id no:17的序列，或者其为seq id no:19和seq idno:20的序列。
45、24.根据项22所述的方法，其中所使用的探针为seq id no:15的序列，或seq idno:18的序列，或seq id no:21的序列。
46、25.根据项17-24中任一项所述的方法，其中在所述患肝癌概率的计算步骤中，预先存储有预先构建的基于甲基化标志物水平的数据拟合的用于计算受试者患肝癌概率的公式。
47、26.根据项25所述的方法，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平的数据拟合得到的。
48、27.根据项25或26所述的方法，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平的数据拟合得到的。
49、28.根据项25-27中任一项所述的方法，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平、chfr的甲基化水平的数据拟合得到的。
50、29.根据项25-28中任一项所述的方法，其中所述公式是将现有数据库中rnf135的甲基化水平、pax5的甲基化水平、chfr的甲基化水平的数据利用广义线性回归拟合得到的。
51、30.根据项25-29中任一项所述的方法，其中所述公式为：
52、p＝e(a*m1+b*m2+c*m3+81)/(e(a*m1+b*m2+c*m3+81)+1)，
53、其中p表示受试者患肝癌概率，m1表示rnf135通过实时荧光定量pcr测定的ct值，m2表示pax5通过实时荧光定量pcr测定的ct值，m3表示chfr通过实时荧光定量pcr测定的ct值，
54、a选自0.8-1.2中的任意数值，优选为0.9；
55、b选自0.6-0.9中的任意数值，优选为0.7；
56、c选自0.1-0.5中的任意数值，优选为0.3。
57、31.根据项17-30中任一项所述的方法，其中当受试者患肝癌的概率大于等于0.24时，判定受试者患有肝癌。
58、32.根据项17-31中任一项所述的方法，其中所述样本为包括：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
59、本技术具有以下有益效果：
60、通过检测rnf135基因、chfr基因和/或pax5基因这三个肝癌甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测这3个基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。通过对肝癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本技术的系统和方法能够灵敏和特异地检测肝癌，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。因此，本技术提供了一种检测肝癌的系统和方法，具有重要的临床应用价值。
61、本技术的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。
62、发明的效果
63、本技术利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析肝癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与肝癌相关的甲基化基因，并确定了肝癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。
64、本技术所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
1.一种检测肝癌的系统，其中所述系统包括：
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述rnf135基因的靶序列如seq id no:1或seq idno:2或seq id no:3或seq id no:4所示。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述chfr基因的靶序列如seq id no:5或seq idno:6或seq id no:7或seq id no:8所示。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述pax5基因的靶序列如seq id no:9或seq idno:10或seq id no:11或seq id no:12所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中所述数据采集模块包括以下子模块：
6.根据权利要求5所述的系统，其中使用实时荧光定量pcr对亚硫酸氢盐试剂处理的基因组dna进行检测。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所使用的引物为seq id no:13和seq id no:14的序列，或者其为seq id no:16和seq id no:17的序列，或者其为seq id no:19和seq idno:20的序列。
8.根据权利要求6所述的系统，其中所使用的探针为seq id no:15的序列，或seq idno:18的序列，或seq id no:21的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中在所述患肝癌概率的计算模块中，预先存储有预先构建的基于甲基化标志物水平的数据拟合的用于计算受试者患肝癌概率的公式。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述公式是基于现有数据库中rnf135的甲基化水平的数据拟合得到的。
