本发明涉及一种dna适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测核酸分子与蛋白质活性的检测方法以及包含该适配体及其复合物的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
背景技术：
1、中心法则是分子生物学最基本最重要的理论之一，它说明了遗传信息的传递方向和遗传信息的表达。dna中的碱基的排列顺序构成了遗传信息。该遗传信息可以通过转录过程形成rna，然后其中的mrna通过翻译产生多肽，形成蛋白质，蛋白质的生物合成和生物性状的表现(新陈代谢、生长发育、组织分化等)都直接与dna紧密相关。dna是构成基因与表达的物质基础，是组成细胞的重要生理活性物质，它支配着生命从诞生到死亡的全过程。
2、核酸适配体(aptamer)是通过selex技术得到的单链核糖核酸(rna)或单链脱氧核糖核酸(dna)。可以理解为核酸组成的抗体，单链dna或者rna在没有互补链存在的情况下，自身经过卷曲和折叠形成特定的三级结构，并形成具备一定功能的分子，功能类似抗体。但是适配体与抗体相比有很多的区别，适配体具有较高的连接特异性、吸附力和相对较小、缺乏免疫原性、易合成、易储存、可进行多种修饰和高稳定性等独特的优势。
3、dna是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础。由于对每一种生物体来说，核酸的序列都是独一无二的。因此，在诊断和识别各种疾病时，这些细菌、病毒、病原体的核酸序列就成为了研究对象。目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，为了能够有效抗击这些疾病，及早和准确地探测dna序列显得尤为重要。dna分子作为分子识别元件和功能化核酸对其互补序列和特定目标物特异性识别，dna适配体分子用于检测各种靶标物质，如核酸、蛋白质、金属离子、细胞等。其被广泛应用于疾病检测和个性化治疗、食品安全、环境检测、材料化学等领域。
4、从grodjicker在l974年创立rflp(restriction fragment lengthpolymorphisms)技术以来，短短二十多年，dna分子标记发展迅速，且种类繁多，特点各异。目前，分子标记技术依其所使用的主要分子生物学技术，大致可分为以传统分子杂交技术为基础的分子标记技术、以pcr为基础的分子标记技术和随机引物pcr。dna分子标记目前在研究上还存在许多缺点和不足：分子标记的种类应用不平衡且灵敏度不够，成本高。核酸适配体本身不发光，需要在反应体系中引入荧光基团引发光信号变化从而进行检测。核酸适配体可以通过标记型和免标记型两类方法产生荧光，其中标记型由于检测灵敏度高、快速响应、可选择标记种类多、具备多重和实时检测能力而成为首选；同时由于核酸适配体具有丰富的功能基团，也经常和多种荧光物质进行无标记的结合；两种方法都有着较为广泛的应用。相较于标记法，免标记的方法更加方便，且成本更低，荧光标记可能对靶标与适配体之间亲和性产生一定影响，因此非荧光标记的荧光适配体生物传感器技术得以发展。本文荧光dna适配体是指一类能够特异性地结合荧光团等小分子物质、诱导和增强其发光的物质，当荧光团分子嵌入dna适配体形成的结合口袋时，分子内运动被阻碍，从而实现人造荧光dna。
5、科学家们构建了一个荧光团-淬灭剂结合体，当荧光团的适配体(aptamer)与荧光团结合时，淬灭剂就不能将荧光团的荧光信号淬灭，此时适配体-荧光团-淬灭剂构成的复合物是有荧光的。当荧光团的适配体不存在时，荧光团的荧光信号就会被淬灭剂淬灭。基于这样的原理，科学家们实现了对细菌中mrna的成像。此外，人们还开发了一个称为image的标签，它由两种不同的适配体-小分子复合物构成。当小分子结合到rna序列中的适配体上时，相邻的两个小分子所携带的荧光团就会发生荧光共振能量转移(fret)现象，通过检测荧光信号的变化就可以检测细胞中dna或者rna的情况。
6、发光的荧光染料表现出优异的性能，即自发荧光非常低，但与适配体相互作用时荧光会大大增加。有机小分子荧光染料多为芳香族化合物，一般情况下具有大的π共轭体系、刚性平面结构和较强的电子基团，这些性质对荧光产生比较有利。不同结构荧光小分子的荧光发射位置不同，对结构进行调整或者引入其他基团都可能引起荧光发射性能的改变。因此，通过改变有机小分子染料的性能可以实现不同检测波长的荧光dna适配体的开发。例如：香豆素类小分子及其衍生物，其发射光谱通常在蓝光区域，荧光素及罗丹明类小分子发射光谱则在绿光、黄光及橙光区域，而苯并吡喃衍生物及花青素类小分子发射光谱在红光及近红外光区域。开发荧光染料适配体将极大地促进用于各种检测目的的无标记探针的开发。
7、在过去的几年里，荧光dna适配体已经成为基于基因编码的荧光生物传感器，用于细胞成像和检测各种目标靶标。荧光探针在细胞生物学和生物医学成像技术的发展中起着核心作用。通过激发光与识别元件的相互作用来反应待测物浓度及其他信息，荧光强度、衰减速率和光谱形状都可以单独或结合作为信号检测手段，具有快速准确、多靶标、高灵敏度、仪器简单等优势。到目前为止，已经将大量基于强度或比率的小分子荧光化合物构建到传感器中。各种染料，例如荧光素，罗丹明，bodipy和cyanine，已被用作这些小分子传感器中的报告分子。
8、对于dna、rna、生物小分子或者生物大分子的检测，有一种方法是实时定量聚合酶链反应(qpcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次pcr循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。qpcr扩增方法因其灵敏度高而被广泛应用于生物分子的检测中。但是其缺点和局限性在于qpcr需要价格昂贵的探针标签以及专业的仪器设备和专门的技术人员进行操作，目前基于rca的放大检测技术，是一种等温、由某些dna聚合酶(如phi29 dna聚合酶)介导的酶放大过程，将dntps转化为单链dna分子，该分子包含数十个或数百个带有13-240个核苷酸的环状模板链的连续重复拷贝。rca技术具有灵敏度高、扩增产率高等优点，因此在dna、蛋白质等的检测中具有广阔的应用前景。
9、第一条非g-四联体荧光dna适配体发现于2016年东京工业大学的研究团队，t.kato等人报道了一种42-mer的dna适配体(dap-10-42)，它与环境敏感的dapoxyl衍生物结合并增强了其荧光。dap-10-42适配体可以融合到其他结合分析物的适配体中。他们设计并开发了两种不同的“开启”传感器，它们可以检测凝血酶或三磷酸腺苷，并且这些与使用荧光g-四联体配体报道的无标记传感器相当。证明了dap-10-42作为信号模块的多功能性，这些传感器是通过简单地去除分析结合适配体和dap-10-42之间茎的碱基对来设计的，茎序列的进一步优化可能会提高它们的准确性。此外，还表明了其他报道的含有适当茎连接到dap-10-42的dna适配体通常也可用于构建新的传感器，大大扩展了这类适配体的用处，开创了非g-四联体传感器的应用，弥补了g-四联体在稳定性和结构方面的不足。最近，r.p.connelly等人报道了dap-10-42适配体除了与dapoxyl有结合外，还可以与各种芳基甲烷染料相互作用，并根据所使用的染料的不同可以在500-600nm范围内产生不同的荧光信号。因此，他们将dap-10-42适配体应用于分裂传感器，以检测结核分枝杆菌的katg基因片段，并成功鉴定出单碱基突变。
10、无标记型荧光生物传感器主要指荧光团或者荧光纳米材料借助非共价交联，引起荧光团或荧光纳米材料荧光的变化，进行荧光信号的输出。常见的荧光纳米材料如纳米金、石墨烯、银纳米簇、量子点等。其中，纳米金、石墨烯等具有光吸收特性，可作为荧光猝灭剂；银纳米簇、量子点这些纳米材料中，银纳米簇的合成模板有很多，其中以dna为模板合成的银簇，其合成方法简单、荧光稳定易于保存，同时根据dna模板的不同还可以改变不同颜色的荧光。ding等人提出了一种无标记荧光策略来研究基于rca的dna花在活细胞中的胞内定位和稳定性。线性dna模板先与引物杂交，随后在t4 dna连接酶作用下得到环状模板。随后，在phi29聚合酶作用下进行rca，rca产生了大量具有串联聚a序列的长链非切割dna片段。这些rca产物被用作自组装单分散、密集和层次dna花(dfs)的构建块。同时，将聚t链与这些dna链杂交，得到咔唑基双氰基荧光基团的对接位点，双氰基荧光基团是dna检测分子，具有分子内旋转限制(rir)诱导的强荧光发射特性。当双菁分子通过静电吸引被包裹在dna花中时，这些受限的rir染料可以产生强烈的荧光。该研究成果可以应用于其他先进的基于dna的材料，为制备荧光dna材料和实现有效载荷的可控释放提供了新的策略。dna自组装最开始是由许多dna短链通过黏性末端相连所形成的组装体，1998年，e.winfree等人设计出首先由单链dna形成双链dna，进而组装成条纹状的dna平面结构，至此dna自组装真正进入了人们的视野。目前，所用于生物传感领域的dna自组装技术主要是指由许多dna分子，借助于watson-crick等碱基互补配对的特性，严格精准的进行互补配对，由dna单链形成dna双链甚至三链结构，再由这些双链结构不断地扩增组合形成新的二维结构、三维结构。其中dna分子单链具有良好的柔韧性，当dna分子单链通过碱基互补配对形成双链后，结构又会变得富有刚性，这就为dna自组装技术创造出灵活又稳定的基础，通过对dna分子进行精确的组装和调控，构建出各种功能和形态的dna纳米装置。目前，dna自组装技术可分为dna模板化组装、dna折纸、dna发夹自组装。dna自组装技术在生物传感器、纳米诊疗、药物的传递、环境卫生以及食品安全检测等领域发挥积极的作用。
11、综上所述，目前使用的基于dna分子的标记技术以及dna的自组装技术均存在一些缺陷，比如现有的无标记型dna分子标记技术本底荧光强，信噪比低；dna自组装技术在生物传感领域得到了广泛应用，而电化学传感器的反应要在电极上进行，在一定程度上限制了dna自组装技术的灵活性，光学生物传感器较电化学生物传感而言，操作更简单，稳定性更高，能够为dna自组装技术提供更深的开发性。基于单荧光团-dna核酸适配体的标记技术目前来说是非常完美的标记技术，然而受限于当前的荧光团(dfhbi，dfhbi-1t，咔唑基双氰基荧光基团)与核酸适配体形成的复合体的性质不理想，该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团-核酸适配体复合物，能克服此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的rna或dna的实时标记。
12、发明的简述
13、1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列n1-ggatccacgaccgggatggaaccagtgggtatgtcatgt gtc-n44，其中n1、n44代表长度≧1个核苷酸的片段且n1与n44核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对且所述核苷酸序列为具有适配体功能的核酸适配体分子；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少85.7％同一性的核苷酸序列且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
14、2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的lemon结构核苷酸序列具有至少85.7％，88.1％，90.5％，92.9％，95.2％，97.6％或100％同一性的序列。
15、3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的lemon结构核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
16、4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
17、5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n44互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5’-3’，n44核苷酸序列的方向为3’-5’。
18、6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n44中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n44核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对。
19、7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3c、g3a、g3t、a4t、a4c、a4g、t5a、t5g、t5c、g10a、g10t、g10c、a11t、a11c、a11g、c12a、c12t、c12g、c13a、c13t、c13g、g14a、g14t、g14c、g15a、g15t、g15c、g16a、g16t、g16c、a17t、a17g、a17c、t18a、t18g、t18c、g19a、g19t、g19c、g20a、g20t、g20c、a21t、a21g、a21c、a22t、a22g、a22c、c23a、c23t、c23g、c24a、c24t、c24g、a25t、a25c、a25g、g30a、g30t、g30c、t31a、t31g、t31c、a32t、a32g、a32c、t33a、t33g、t33c、g34a、g34t、g34c、t35a、t35g、t35c、c36a、c36t、c36g、a37t、a37g、a37c、t38a、t38g、t38c、g39a、g39t、g39c、t40a、t40g、t40c、g41a、g41t、g41c、t42a、t42g、t42c、c43a、c43t、c43g、c2t/g3t、c2t/a4c、c2t/t5a、g3t/a4c、g3t/t5a、a4c/t5a、c2t/g3t/a4c、c2t/g3t/t5a、c2t/a4c/t5a、g3t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、a37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/t42g、g41a/c43g、t42g/c43g、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/t42g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t38g/g41a/t42g、t38g/g41a/c43g、t38g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、g41a/t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、a37t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t8g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、a37t/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t38g/g41a/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a37t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/t40g/t42g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g/c43g。
20、8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3a、g3t、a4t、a4c、a4g、t5a、t5g、t5c、a11g、c12a、c13a、c13t、c13g、a17t、t18a、t18g、t18c、a21c、a22g、c23a、c23t、a32g、t33a、a37t、a37g、t38a、t38g、t40a、t40g、t40c、g41a、g41t、g41c、t42a、t42g、t42c、c43a、c43t、c43g、c2t/a4c、c2t/t5a、g3t/t5a、a4c/t5a、c2t/g3t/ta、c2t/a4c/t5a、g3t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、a37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/t42g、g41a/c43g、t42g/c43g、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t38g/g41a/t42g、t38g/g41a/c43g、t38g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、g41a/t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、7t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t38g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、a37t/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t38g/g41a/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a37t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/t40g/t42g/c43g、37t/t38g/g41a/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g/c43g。
21、9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3t、a4t、a4c、t5a、t5g、t5c、a11g、c13a、c13t、a17t、t18a、t18g、a22g、c23t、a37t、a37g、t38a、t38g、t40a、t40g、g41a、g41c、t42g、c43g、c2t/t5a、a4c/t5a、c2t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/c43g、t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t38g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a7t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g/c43g。
22、10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n44处的核苷酸序列优选为2对及以上的碱基互补配对。
23、11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna分子或经修饰的dna分子。
24、12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna-rna杂交分子或经硫代、磷酸化、amino c7、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰的dna分子。
25、13.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中所述核酸适配体分子还可包含它的循环更替突变体。所述循环更替突变体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：10、11或12。
26、14.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少5倍，至少5-15倍，至少15-40倍或者提高至少40-50倍。
27、15.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：13、14、15或16。
28、16.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的核酸适配体分子具有序列seqid no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、19或20。
29、17.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-15任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(i)所述的结构：
30、
31、其中：ar1、ar2独立地为六元芳基、六元芳杂基；d-为n(x1)(x2)-，x1、x2各自独立地选自氢、烷基和改性烷基；x1，x2任选相互连接，与n原子一起形成脂杂环；当d-为n(x1)(x2)-，ar1为苯基时，x1，x2独立地与苯环形成饱和或不饱和的酯杂环；y为o、s；r1为氢、烷基和改性烷基；r2为氢原子、卤原子、-oh、-cn；
32、其中：所述“烷基”各自独立地为c1-c10直链或支链烷基；可选地，为c1-c7直链或支链烷基；可选地，为c1-c5直链或支链烷基；可选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；
33、18.如19所述的荧光团分子的复合物，所述“改性烷基”各自独立地为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-oh、-co-、-o-、-cn、-so3h、伯氨基、仲氨基、叔氨基的一种或多种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；
34、所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
35、所述“改性亚烷基”为c1-c10(优选为c1-c6)亚烷基的任意碳原子被选自-o-、-oh、-co-、-cs-、-(s＝o)-中的基团置换所得的基团；
36、可选地，所述“改性烷基”为含有选自-oh、-o-、乙二醇单元(-(ch2ch2o)n-)、单糖单元、-o-co-、-nh-co-、-so2-o-、-so-、me2n-、et2n-、-s-s-、-ch＝ch-、f、cl、br、i、氰基中的一种或多种基团；
37、可选地，ar1为选自下式(ⅱ-1)～(ⅱ-15)中的结构：
38、
39、ar2选自下式(ⅲ-1)～(ⅲ-25)中的结构：
40、
41、可选地，式(i)所示的化合物选自下式化合物：
42、
43、
44、19.根据权利要求17所述的复合物，其中的荧光团分子选自iv-1、iv-2、iv-3、iv-4、iv-5、iv-6、iv-7、iv-8、iv-9、iv-10、iv-11、iv-12、iv-13、iv-14、iv-15、iv-16、iv-17、iv-18、iv-19、iv-20、iv-21、iv-22。
45、20.根据权利要求17-19任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19或20。
46、21.根据权利要求17-20任一项所述的复合物，用于蛋白质的活性测定。
47、22.一种试剂盒，包含权利要求1-16任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求16-19所述的任一项所述的复合物与和/或权利要求21所述的蛋白质的活性测定方法。
48、本发明人设计了全新的核酸适配体分子，并与不同的荧光团分子，组成全新的核酸适配体-荧光团复合物，适配体分子结合荧光团分子之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度，它们克服了此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，具有高亲和力、高激活倍数和高热稳定性等优点。本发明的核酸适配体对荧光团分子具有很强的亲和力，并展现出了不同的荧光光谱和很好的光与温度稳定性。这些核酸适配体-荧光团分子复合物可以结合信号放大等技术实现高灵敏的dna、rna、蛋白质、小分子等靶标分子的检测。除此之外，结合dna自组装技术可以为实现纳米诊疗、药物的传递、环境卫生以及食品安全检测等领域发挥积极的作用。
技术实现思路
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列n1-ggatccacgaccgggatggaaccagtgggtatgtcatgtgtc-n44，其中n1、n44代表长度≧1个核苷酸的片段且n1与n44核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对且所述核苷酸序列为具有适配体功能的核酸适配体分子；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少85.7％同一性的核苷酸序列且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的lemon结构核苷酸序列具有至少85.7％，88.1％，90.5％，92.9％，95.2％，97.6％或100％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的lemon结构核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n44互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5’-3’，n44核苷酸序列的方向为3’-5’。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n44中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n44核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对。
7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3c、g3a、g3t、a4t、a4c、a4g、t5a、t5g、t5c、g10a、g10t、g10c、a11t、a11c、a11g、c12a、c12t、c12g、c13a、c13t、c13g、g14a、g14t、g14c、g15a、g15t、g15c、g16a、g16t、g16c、a17t、a17g、a17c、t18a、t18g、t18c、g19a、g19t、g19c、g20a、g20t、g20c、a21t、a21g、a21c、a22t、a22g、a22c、c23a、c23t、c23g、c24a、c24t、c24g、a25t、a25c、a25g、g30a、g30t、g30c、t31a、t31g、t31c、a32t、a32g、a32c、t33a、t33g、t33c、g34a、g34t、g34c、t35a、t35g、t35c、c36a、c36t、c36g、a37t、a37g、a37c、t38a、t38g、t38c、g39a、g39t、g39c、t40a、t40g、t40c、g41a、g41t、g41c、t42a、t42g、t42c、c43a、c43t、c43g、c2t/g3t、c2t/a4c、c2t/t5a、g3t/a4c、g3t/t5a、a4c/t5a、c2t/g3t/a4c、c2t/g3t/t5a、c2t/a4c/t5a、g3t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、a37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/t42g、g41a/c43g、t42g/c43g、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/t42g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t38g/g41a/t42g、t38g/g41a/c43g、t38g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、g41a/t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、a37t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t8g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、a37t/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t38g/g41a/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a37t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/t40g/t42g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g/c43g。
8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3a、g3t、a4t、a4c、a4g、t5a、t5g、t5c、a11g、c12a、c13a、c13t、c13g、a17t、t18a、t18g、t18c、a21c、a22g、c23a、c23t、a32g、t33a、a37t、a37g、t38a、t38g、t40a、t40g、t40c、g41a、g41t、g41c、t42a、t42g、t42c、c43a、c43t、c43g、c2t/a4c、c2t/t5a、g3t/t5a、a4c/t5a、c2t/g3t/ta、c2t/a4c/t5a、g3t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、a37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/t42g、g41a/c43g、t42g/c43g、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t38g/g41a/t42g、t38g/g41a/c43g、t38g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、g41a/t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、7t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t38g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、a37t/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t38g/g41a/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a37t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/t40g/t42g/c43g、37t/t38g/g41a/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g/c43g。
9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式lemon结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2g、c2a、c2t、g3t、a4t、a4c、t5a、t5g、t5c、a11g、c13a、c13t、a17t、t18a、t18g、a22g、c23t、a37t、a37g、t38a、t38g、t40a、t40g、g41a、g41c、t42g、c43g、c2t/t5a、a4c/t5a、c2t/a4c/t5a、a37t/t38g、a37t/t40g、a37t/g41a、37t/t42g、a37t/c43g、t38g/t40g、t38g/g41a、t38g/t42g、t38g/c43g、t40g/g41a、t40g/t42g、t40g/c43g、g41a/c43g、t42g/c43g、c2t/g3t/a4c/t5a、a37t/t38g/t40g、a37t/t38g/g41a、a37t/t38g/t42g、a37t/t38g/c43g、a37t/t40g/g41a、a37t/t40g/t42g、a37t/t40g/c43g、a37t/g41a/c43g、a37t/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a、t38g/t40g/t42g、t38g/t40g/c43g、t40g/g41a/t42g、t40g/g41a/c43g、t40g/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a、a37t/t38g/t40g/t42g、a37t/t38g/t40g/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g、a37t/t38g/g41a/c43g、a37t/t38g/t42g/c43g、a37t/t40g/g41a/t42g、a37t/t40g/g41a/c43g、a37t/t40g/t42g/c43g、t38g/t40g/g41a/c43g、t38g/t40g/t42g/c43g、t40g/g41a/t42g/c43g、a37t/t38g/t40g/g41a/t42g、a7t/t38g/t40g/g41a/c43g、a37t/t38g/g41a/t42g/c43g。
10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n44处的核苷酸序列优选为2对及以上的碱基互补配对。
11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna分子或经修饰的dna分子。
12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna-rna杂交分子或经硫代、磷酸化、amino c7、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰的dna分子。
13.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中所述核酸适配体分子还可包含它的循环更替突变体。所述循环更替突变体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：10、11或12。
14.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少5倍，至少5-15倍，至少15-40倍或者提高至少40-50倍。
15.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：13、14、15或16。
16.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的核酸适配体分子具有序列seq idno：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、19或20。
17.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-15任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(i)所述的结构：
18.如19所述的荧光团分子的复合物，所述“改性烷基”各自独立地为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-oh、-co-、-o-、-cn、-so3h、伯氨基、仲氨基、叔氨基的一种或多种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；
19.根据权利要求17所述的复合物，其中的荧光团分子选自iv-1、iv-2、iv-3、iv-4、iv-5、iv-6、iv-7、iv-8、iv-9、iv-10、iv-11、iv-12、iv-13、iv-14、iv-15、iv-16、iv-17、iv-18、iv-19、iv-20、iv-21、iv-22。
20.根据权利要求17-19任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19或20。
21.根据权利要求17-20任一项所述的复合物，用于蛋白质的活性测定。
22.一种试剂盒，包含权利要求1-16任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求16-19所述的任一项所述的复合物与和/或权利要求21所述的蛋白质的活性测定方法。
