一种检测解脲脲原体核酸的dna探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及核酸检测技术领域，具体的是一种检测解脲脲原体核酸的dna探针及其应用。
背景技术：2.解脲脲原体(ureaplasma urealyticum)属于支原体科中的脲原体属，与男女性生殖道炎症、hiv感染、不孕不育、不良妊娠结局以及新生儿疾病等有关。目前临床上检测解脲脲原体的方法主要有培养法、免疫法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)法。
3.培养法检测解脲脲原体是传统的病原学检测方法，但由于检测耗时，并且易受标本取材多少，送检时间等因素影响导致假阴性。免疫法操作简单，耗时较短，但是特异性和敏感性却不够理想。pcr法灵敏度高，特异性强，但是需要专门的技术人员，对仪器也有特定的要求，在基层单位和偏远地区不能普及开来。
技术实现要素：4.为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种检测解脲脲原体核酸的dna探针及其应用，可快速、廉价、高灵敏度地检测解脲脲原体。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种检测解脲脲原体核酸的dna探针，所述dna探针包括探针h1和探针h2，dna探针与目标序列混合进行催化发夹自组装反应；
7.dna探针h1的序列如seq id no.2所示；
8.dna探针h2的序列如seq id no.3所示。
9.进一步优选地，h1的5’端修饰有地高辛，h2的5’端修饰有生物素。
10.进一步优选地，dna探针以序列如seq id no.1所示的基因作为检测靶标。
11.一种dna探针在在制备检测解脲脲原体产品中的应用。
12.一种解脲脲原体核酸的检测方法，包括以下检测步骤：
13.(1)取阴道分泌物，并将拭子头浸入含细胞保存液的取样管中；
14.(2)取200μl上述的待测标本，加入到含有h1和h2冻干粉的试管中；充分混匀后，至于35℃水浴锅中，水浴反应15分钟；
15.(3)水浴后，取80μl上述反应液分别滴加在免疫分析试纸条的加样孔中，5-10分钟后，将分析试纸条插入荧光检测仪，读取检测线和质控线的荧光值。
16.本发明的有益效果：
17.本发明所提供的等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法准确率高、操作简单，所需时间短。与pcr不同，由于本发明是无酶信号扩增系统，故无需用到成本较高的dna聚合酶，故能明显降低检测成本，可适用于大规模的筛查和即时检测，可满足未配备pcr仪器的基层医院进行快速检测。
附图说明
18.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
19.图1是本发明催化发夹型dna自组装反应的具体步骤；
20.图2是本发明免疫分析试纸条检测dig和bio双修饰的h1-h2杂交双链的原理；
21.图3是本发明非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证催化发夹型dna自组装反应用于检测解脲脲原体的可行性分析结果；
22.图4是本发明等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法的灵敏度分析结果；
23.图5是本发明等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法的特异性度分析结果；
24.图6是本发明等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法对临床标本的检测结果。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.检测探针冻干粉的制备
28.本发明根据已公开的解脲脲原体序列进行多序列比对，筛选出mba基因中长度为22个碱基的保守序列作为检测靶标。序列分别如下：
29.根据mba基因的保守序列设计两个探针，分别记为h1和h2。上述探针h1的5’端标记地高辛(digoxin，dig)，而h2探针的5’端则用生物素(biotin，bio)修饰。相关序列见下表(表1)：
30.表1探针序列
[0031][0032][0033]
将所制备的探针分别用tae/mg
2+
缓冲液溶解至100nm/l后，进行退火处理，让各探针保持发夹结构，退火温度为：从95℃以1℃/min的速度缓慢降温至25℃。退火处理后，取h1探针和h2探针用tae/mg
2+
缓冲液稀释成10nm/l。取100μl稀释后的h1和50μl释后的h2混合于ep管中。将混合物至于真空冻干机做冻干处理。
[0034]
实施例2
[0035]
等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法灵敏度分析
[0036]
根据选定的检测序列合成单链dna，用于分析该系统的检测灵敏度。以mba基因的保守区为检测靶点，合成单链dna，同时，根据靶向序列随机生成随机序列作为对照组。将合成的dna片段分别用tae/mg
2+
缓冲液稀释成100μm/l，再分别用正常健康人群的阴道分泌物标本液进行梯度稀释(1nm～1fm)。分别取200μl梯度目的dna溶液，加入基因探针冻干粉中，充分混匀后，至于37℃水浴锅中反应15分钟。反应结束后，取80μl反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，5-10分钟后，荧光分析仪读取检测线(t-line)和质控线(c-line)的荧光值。结果如图4所示，以阴性对照荧光值的均值+3个标准差设置cutoff值。阴性对照荧光值为53.8
±
13.6，所得cutoff值为94.6。根据cutoff值可知，本发明的检测方法的灵敏度(即最低检测浓度)为1fm。
[0037]
实施例3
[0038]
等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法特异性分析
[0039]
根据选定的检测序列(图3)合成单链dna，随机生成1个单碱基突变序列(记为smtd)和1个双碱基突变序列(记为dmtd)，分别合成单链dna。序列分别如表2所示。将各序列分别用tae/mg
2+
缓冲液稀释成100pm的待测溶液，取200μl上述待测液标本加入到试管中，充分混匀后，至于37℃水浴锅中反应15分钟。反应结束后，取80μl反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，5-10分钟后，荧光分析仪读取检测线(t-line)和质控线(c-line)的荧光值。结果如图5所示，四管分别加入t、dmtd、smtd和缓冲液，本发明的检测方法具有高度的序列特异性，单碱基突变即可引起检测荧光值的明显下降，其荧光值与双突变的对照序列相当，都和空白对照组接近。
[0040]
表2特异性分析使用序列
[0041][0042]
表注：突变位点以下标线标记。
[0043]
实施例4
[0044]
等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法用于临床样本检测
[0045]
取10例经pcr证实的解脲脲原体感染的患者的阴道分泌物标本，及10例经pcr证实无解脲脲原体感染的阴道分泌物标本作为阴性对照。标本经dna提取后，取200μl加入到试管中，充分混匀后，至于37℃水浴锅中反应15分钟。反应结束后，取80μl反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，5-10分钟后，荧光分析仪读取检测线(t-line)和质控线(c-line)的荧光值。结果如图6所示，10例解脲脲原体阳性患者的阴道分泌物标本的平均荧光值为154.1
±
36.9，均在100以上。而10例对照组的检测值为40.0
±
11.4。解脲脲原体阳性的标本检测的荧光值较对照组均有统计学差异(p《0.001)。结果表明，本发明的等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的解脲脲原体核酸检测方法
可用于检测解脲脲原体。
[0046]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
技术特征：1.一种检测解脲脲原体核酸的dna探针，其特征在于，所述dna探针包括探针h1和探针h2，dna探针与目标序列混合进行催化发夹自组装反应；dna探针h1的序列如seq id no.2所示；dna探针h2的序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的检测解脲脲原体核酸的dna探针，其特征在于，所述h1的5’端修饰有地高辛，h2的5’端修饰有生物素。3.根据权利要求1所述的检测解脲脲原体核酸的dna探针，其特征在于，所述dna探针以序列如seq id no.1所示的基因作为检测靶标。4.一种如权利要求1-4任一项所述dna探针在在制备检测解脲脲原体产品中的应用。5.一种解脲脲原体核酸的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：(1)取阴道分泌物，并将拭子头浸入含细胞保存液的取样管中；(2)取200μl上述的待测标本，加入到含有h1和h2冻干粉的试管中；充分混匀后，至于35℃水浴锅中，水浴反应15分钟；(3)水浴后，取80μl上述反应液分别滴加在免疫分析试纸条的加样孔中，5-10分钟后，将分析试纸条插入荧光检测仪，读取检测线和质控线的荧光值。
技术总结本发明公开一种检测解脲脲原体核酸的DNA探针及其应用，所述DNA探针包括探针H1和探针H2，DNA探针与目标序列混合进行催化发夹自组装反应，DNA探针H1的序列如SEQIDNO.2所示，DNA探针H2的序列如SEQIDNO.3所示，探针H1的5’端由地高辛修饰，探针H2的5’端由生物素修饰。本发明利用DNA探针与目标序列混合催化发夹自组装反应结合免疫层析试纸条，在等温无酶扩增环境下即可快速、高灵敏度、高特异性地检测解脲脲原体。脲原体。脲原体。
技术研发人员：吴国球 范小波 肖枫
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
