本发明属于天然药物制备领域，具体地说，涉及一种滇乌碱的制备方法、应用与草乌甲素的质量控制方法。
背景技术：
1、草乌甲素(bulleyaconitine a，分子式c35h49no10，分子量643.76)又名滇西嘟拉碱甲，为白色结晶或结晶性粉末，最早是从毛莨科乌头属植物滇西嘟拉(aconitumbulleyanum diels)中分离出的一种具有生物活性的生物碱。因其具有较强的镇痛及免疫调节等药理活性，现如今作为一种现代植物药，广泛应用于风湿性及类风湿性关节炎、骨关节炎、腰肌劳损、肩周炎、四肢扭伤等的治疗。草乌甲素具有镇痛时间长，副作用小，疗效明确且对器官无明显损伤等特点。相比于传统的镇痛药，草乌甲素没有阿片类镇痛药的成瘾性及耐受性等副作用，也没有非甾体消炎药类镇痛药的胃肠道损伤、出血及肾毒性等不良反应。
2、目前上市的草乌甲素药物剂型种类丰富，有草乌甲素片剂、胶囊剂、口服溶液剂、注射剂。临床上对草乌甲素新剂型和新适应症的研究也相继报道。随着草乌甲素制剂在临床上的广泛应用，对于草乌甲素原料药的质量控制也越来越严格。中国药典(2020版)第二部中对草乌甲素质量控制，按照干燥品计算，含草乌甲素不得少于97.0％，检查项下，其他生物碱限度按照供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积(2.0％)。现有的草乌甲素的质量控制中，并未对草乌甲素中的杂质进行定位归属，各杂质含量也未进行精确控制，也未有现行的杂质对照品供使用。
3、药物的杂质水平是影响药品质量的主要因素之一，合理控制药物成品中的杂质含量，对于提升药品质量，保证患者用药安全显得尤为重要。目前杂质的研究工作成为多数药物研发机构和生产厂家的薄弱环节，主要有两个方面原因：一是技术难度较大，每一种药物都可能有多种杂质存在，而且其含量往往很低，对其进行分离、结构确证和合成制备存在较大困难；二是这些物质用量相对较小，难以实现规模化生产，虽然社会效益很大，但难以取得大的经济效益，因此一般企业不愿意投入人力物力研究开发。
4、目前，已知滇乌碱为草乌甲素主要杂质。滇乌碱的结构式如下式i所示：
5、
6、现有技术中还未见有关成功制备滇乌碱的相关制备方法的报道。而为了控制工艺中的杂质情况，获得高纯度的滇乌碱杂质对照品，对开发和验证分析方法、确证样品中的杂质归属、保证药品质量至关重要，因此，亟待需要开发滇乌碱的制备方法。
7、有鉴于此特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种滇乌碱的制备方法、应用与草乌甲素的质量控制方法。本发明的制备方法制备的滇乌碱的纯度高，收率高，可以作为杂质对照品用于草乌甲素的质量控制，提高了现有草乌甲素的药品质量和临床用药安全。
2、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
3、本发明的提供一种滇乌碱的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)粉碎和提取：取乌头块根，粉碎成乌头粗粉；在乌头粗粉中加入酸化的乙醇溶液，室温浸泡，合并提取液，减压浓缩至无醇味，回收乙醇溶液，得提取浓缩液；
5、(2)水沉：将上述提取浓缩液静置水沉，水沉液过滤，滤渣用水洗涤，合并滤液；
6、(3)萃取：向上述滤液中加入碱液，调节ph；用有机溶剂萃取，合并有机相，减压浓缩至干，得萃取浸膏；
7、(4)柱层析分离：将萃取浸膏溶解，加入硅胶拌样，硅胶柱层析加压洗脱，收集仅含滇乌碱的洗脱段，减压浓缩，得到滇乌碱粗品；
8、(5)精制脱色：将滇乌碱粗品用乙醇加热溶解，后缓慢降温结晶，抽滤，用少量乙醇洗涤晶体，即得滇乌碱纯品。
9、进一步的方案，步骤(1)中，所述酸化的乙醇溶液中，乙醇溶液的体积浓度为65-85％；酸化所用的酸的体积为乙醇溶液的0.1％～0.5％；
10、优选的，酸化所用的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸中的一种或几种。
11、进一步的方案，步骤(1)中，加入的酸化的乙醇溶液的体积为乌头粗粉重量的5-8倍；
12、优选的，浸泡时长为1-6小时，浸泡次数为2-5次；浸泡采用静态或动态方式。
13、进一步的方案，步骤(2)中，静置水沉的时间为6-12h。
14、进一步的方案，步骤(3)中，加入碱液后调节ph至6-9；
15、优选的，所述碱液选自氨水溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的一种或几种。
16、优选的，有机溶剂的体积用量为调节ph后溶液体积的2-4倍；
17、进一步的方案，采用有机溶剂进行萃取的次数为2-5次；
18、优选的，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、丁酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种。
19、进一步的方案，步骤(4)中，萃取浸膏用有机溶剂溶解，加入1-3倍硅胶拌样，制成样品；
20、柱层析硅胶用量为样品质量的5-10倍。
21、优选的，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、丁酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种。
22、进一步的方案，步骤(4)中，采用石油醚：丙酮的体积比为5:1-10:1的混合液作为洗脱剂，二乙胺调节ph至10-13，进行等梯度洗脱；优选的，采用石油醚：丙酮的体积比为6:1的混合液作为洗脱剂，二乙胺调节ph至12-13；
23、优选的，加压层析洗脱时，控制洗脱速度为1.0-8.0bv/h；优选洗脱速度为2.0-4.0bv/h。
24、进一步的方案，步骤(5)中，所述乙醇的浓度为70-100％，乙醇体积为滇乌碱粗品重量的2-7倍；
25、优选的，所述乙醇的浓度为95％及以上，乙醇体积为滇乌碱粗品重量的2-3倍；
26、优选的，所述结晶温度为-10-30℃，结晶时间0.5-2小时；
27、更优选的，所述结晶温度为15-25℃，结晶时间为1-1.5小时。
28、本发明中，所述的乌头块根为乌头属植物的块根，本发明的制备方法适用于现有技术中可以作为滇乌碱提取来源的任何类型的乌头属植物，例如长喙乌头等等。
29、本发明制备的滇乌碱纯品，纯度为97.2％以上，优选可以达到99％以上。滇乌碱纯品的纯度采用高效液相色谱法进行检测，检测方法包括：
30、(1)色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2％三乙胺水溶液(用磷酸调节ph值至3.1±0.1)-乙腈(65∶35)为流动相；柱温30℃；检测波长为260nm。理论板数按滇乌碱峰计算应不低于3000。
31、(2)测定方法取制备的滇乌碱约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；按面积归一化计算，即得。
32、本发明还提供一种如上所述的制备方法制备的滇乌碱作为草乌甲素的质量控制检测中杂质对照品的应用。
33、本发明的制备方法制备的滇乌碱，其hplc纯度可以达到99％以上，可满足其用于杂质对照品用途的要求。在进行草乌甲素有关物质检测时，将滇乌碱做为杂质对照品，采用高效液相色谱法测定草乌甲素中杂质滇乌碱的含量，有利于提高草乌甲素的质量控制标准。
34、本发明还提供一种草乌甲素的质量控制方法，包括如下步骤：
35、(1)采用如上所述的制备方法制备的滇乌碱和草乌甲素标准品制备对照品溶液；
36、(2)制备草乌甲素供试品溶液；
37、(3)将对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱测定；色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为65∶35的0.2％三乙胺水溶液-乙腈为流动相；柱温30℃；检测波长为260nm；理论板数按滇乌碱峰计算应不低于3000；
38、优选的，所述的0.2％三乙胺水溶液用磷酸调节ph值至3.1±0.1；
39、优选的，对照品溶液的制备包括：分别取滇乌碱和草乌甲素标准品，加流动相溶解并稀释，配置成一定浓度的对照品溶液。
40、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
41、1、本发明提供的制备滇乌碱的制备方法，采用酸化的乙醇溶液对乌头粗粉进行浸泡提取，再配合适宜条件的水沉、萃取、柱层析分离和乙醇脱色，能够制备纯度达到97.2％以上的滇乌碱，优选可以达到99％以上，不仅产品纯度高，且收率高，制备方法操作简单、安全、环保、不产生难处理废液。
42、2、本发明制备的高纯度的滇乌碱，可以作为草乌甲素的质量控制检测中的杂质对照品，从而控制草乌甲素原料或制剂的纯度，提高了现有草乌甲素的药品质量和临床用药安全。
43、3、本发明提供的草乌甲素的质量控制方法，以滇乌碱作为杂质对照品，采用适宜的高效液相检测条件，不需要考虑校正因子，对草乌甲素和滇乌碱的检测结果准确，有利于提高草乌甲素的药品质量和临床用药安全。
44、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
1.一种滇乌碱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸化的乙醇溶液中，乙醇溶液的体积浓度为65-85％；酸化所用的酸的体积为乙醇溶液的0.1％～0.5％；
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入的酸化的乙醇溶液的体积为乌头粗粉重量的5-8倍；
4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，静置水沉的时间为6-12h。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，加入碱液后调节ph至6-9；
6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，萃取浸膏使用有机溶剂溶解，加入1-3倍硅胶拌样，制成样品；
7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用石油醚：丙酮的体积比为5:1-10:1的混合液作为洗脱剂，二乙胺调节ph至10-13，进行等梯度洗脱；优选的，采用石油醚：丙酮的体积比为6:1的混合液作为洗脱剂，二乙胺调节ph至12-13；
8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙醇的浓度为70-100％，乙醇体积为滇乌碱粗品重量的2-7倍；
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备的滇乌碱作为草乌甲素的质量控制检测中杂质对照品的应用。
10.一种草乌甲素的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
