本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其mlta基因和plda基因被突变，由此具有提高的细菌外膜囊泡(omv)产量。本发明还涉及产生所述经修饰的百日咳鲍特菌菌株的方法和通过所述经修饰的百日咳鲍特菌菌株产生omv的方法。
背景技术：
1、百日咳鲍特菌( bordetella pertussis)引起人类百日咳(whooping cough)，百日咳在一岁以下儿童中最为严重。第一种百日咳疫苗由灭活的全细胞组成，大约在1940年代推出。疫苗的使用使得百日咳病例显著下降，但疫苗引起的副作用，如由于疫苗中存在内毒素而导致的神经系统疾病和发热，值得关注。1980年代，日本开发了第一种无细胞疫苗，现在无细胞疫苗被广泛使用。尽管现在的疫苗接种率很高，但由于流行的百日咳杆菌株的遗传变化以及接种全细胞或无细胞百日咳疫苗后诱导的免疫力差异等原因，百日咳病例正在重新激增。
2、新一代疫苗可以基于外膜囊泡(omv)。omv是从外膜(om)挤出的泡，尺寸在20 nm到200 nm之间。omv被认为是革兰氏阴性菌通过出芽的过程形成，而出芽被认为与外膜和肽聚糖层之间的联系减弱或蛋白质等物质在周质空间的积累有关。omv在长距离递送、生物膜形成、细菌存活、菌群相互作用的调节中发挥作用。一方面，omv体积小，很容易被抗原呈递细胞吸收；另一方面，omv与细菌有很多共同点，更接近模拟自然感染；再另一方面，omv含有lps，可以作为天然佐剂发挥作用。因此百日咳鲍特菌omv与现有的全细胞百日咳疫苗、无细胞百日咳疫苗相比，具有增强的免疫原性。
3、值得注意的是，omv的产量因物种、菌株、生长期而异。百日咳鲍特菌分泌的omv作为疫苗的瓶颈在于百日咳鲍特菌omv产量极低，该特性使得百日咳鲍特菌omv疫苗的研发及生产面临巨大的挑战。提高omv产量成为开发百日咳omv疫苗亟待解决的问题。
4、细菌omv增产的手段有多种，可分为从发酵工艺方面提高产量和从菌株方面提高产量两大类。
5、从发酵工艺方面着手，可以通过诱导的方式提高omv的分泌量，但与天然分泌得到omv相比，存在不足之处。例如，使用去垢剂诱导omv分泌，会使得形成的omv丢失有佐剂效应的lps和可能有免疫原性的脂蛋白；使用超声诱导omv分泌，会使得omv产品中混有内膜的污染；使用edta等试剂诱导omv分泌，可能会降低omv膜的稳定性；加热诱导omv分泌，可能会改变omv膜的磷脂组成。
6、从菌株方面着手，可以通过对omv分泌过程相关基因的编辑实现omv产量的提高。常用的策略有3种。第一种策略是削弱外膜与肽聚糖层的结合，使得外膜松散易形成囊泡分泌。外膜脂蛋白是外膜与肽聚糖结合的关键桥梁，减少外膜脂蛋白的含量是降低外膜与肽聚糖层结合的重要手段。例如，敲除外膜脂蛋白基因lpp、ompa及其类似基因(如rmpm)、tol/pal等可使得细菌实现omv过度分泌。第二种策略是增加外膜上的磷脂含量以提高外膜曲率。例如，敲除外膜的磷脂酶基因plda以减少磷脂的降解、破坏外膜磷脂向内膜的转运系统-mla系统均可实现omv过度分泌。第三种策略是增加周质空间的内部压力以促进omv分泌。例如可敲除周质空间的分子伴侣蛋白基因degp以增加周质空间错误折叠蛋白的积累、破坏肽聚糖的循环利用等。
7、虽然lpp基因在大肠杆菌中敲除可使得大肠杆菌omv增产160倍，但是百日咳鲍特菌中无该基因及其同源基因存在。eline f. de jonge等人发现百日咳鲍特菌中rmpm、tolr和pal基因的失活失败，推测原因可能是rmpm、tolr和pal (pg-associated lipoprotein)基因的产物在百日咳鲍特菌中是必不可少的。进一步地，eline f. de jonge等人构建了条件性pal基因突变体，这些突变体在pal耗竭地条件下增加百日咳鲍特菌omv的产量，但与野生型细胞释放的omv的组成不同(research in microbiology, volume 173, issues 4-5,2022, 103937)。ompa基因编码一种百日咳鲍特菌菌株的外膜蛋白质。有研究表明，在大肠杆菌中敲除ompa可实现omv增产26倍。但cn116438193a提到百日咳鲍特菌中的ompa及其同系物似乎是百日咳鲍特菌存活所必需的蛋白质，百日咳鲍特菌中的ompa缺失不利于其存活力。可见，在其他细菌上能增产omv的方法，未必能在百日咳鲍特菌上适用。
8、因此，亟需开发新的提高百日咳鲍特菌omv产量的方法，以开发基于omv的新型百日咳疫苗。
技术实现思路
1、在一方面，本发明提供一种经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其与相应对照百日咳鲍特菌菌株相比，在mlta基因中包含突变，并由此具有提高的细菌外膜囊泡(omv)产量。在一些实施方案中，所述的经修饰百日咳鲍特菌菌株还在plda基因中包含突变。
2、在另一方面，本发明提供一种产生经修饰的百日咳鲍特菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
3、a) 向百日咳鲍特菌菌株中的plda基因导入突变，由此获得plda基因中包含突变的经修饰的百日咳鲍特菌菌株；和
4、b) 向步骤a)中获得的经修饰的百日咳鲍特菌菌株中的mlta基因导入突变，由此获得mlta基因中包含突变的经修饰的百日咳鲍特菌菌株。
5、在另一方面，本发明提供一种产生百日咳鲍特菌外膜囊泡(omv)的方法，所述方法包括以下步骤：
6、a) 在适合产生外膜囊泡(omv)的条件下，培养本发明的经修饰的百日咳鲍特菌菌株；和
7、b) 回收并任选地纯化步骤a)中产生的omv。
8、在另一方面，本发明提供一种通过本发明的方法产生的omv。
9、在另一方面，本发明还提供一种组合物，其包含
10、1) 本发明的经修饰的百日咳鲍特菌菌株；和/或
11、2) 本发明的百日咳鲍特菌外膜囊泡(omv)。
12、在一方面，本发明提供了本发明的经修饰的百日咳鲍特菌菌株和/或本发明的百日咳鲍特菌外膜囊泡(omv)在制备用于预防或治疗百日咳鲍特菌感染的组合物中的用途。
13、在一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗对象中的百日咳鲍特菌感染的方法，该方法包括向所述对象施用有效量的本发明的经修饰的百日咳鲍特菌菌株、本发明的百日咳鲍特菌外膜囊泡(omv)和/或本发明的组合物。
1.一种经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其与相应对照百日咳鲍特菌菌株相比，在mlta基因中包含突变，并由此具有提高的细菌外膜囊泡(omv)产量。
2.根据权利要求1所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述mlta基因中的突变导致减少的mlta蛋白表达或导致表达活性降低的突变mlta蛋白。
3.根据权利要求1所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述mlta基因中的突变导致所述菌株不表达mlta蛋白或表达失活的mlta蛋白。
4.根据权利要求1所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述mlta基因中的突变包括mlta基因的缺失。
5.根据权利要求1所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述mlta基因编码seq idno:6所示氨基酸序列或包含seq id no:7所示核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其还在plda基因中包含突变。
7.根据权利要求6所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述plda基因中的突变导致减少的plda蛋白表达或导致表达活性降低的突变plda蛋白。
8.根据权利要求6所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述plda基因中的突变导致所述菌株不表达plda蛋白或表达失活的plda蛋白。
9.根据权利要求6所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述plda基因中的突变包括plda基因的缺失。
10.根据权利要求6所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其中所述plda基因编码seq idno:10所示氨基酸序列或包含seq id no:11所示核苷酸序列。
11.根据权利要求1所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，其衍生自baa-589株。
12.一种产生经修饰的百日咳鲍特菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述的方法，其中plda基因中导入的突变导致所述菌株不表达plda蛋白或表达失活的plda蛋白；mlta基因中导入的突变导致所述菌株不表达mlta蛋白或表达失活的mlta蛋白。
14.根据权利要求12所述的方法，其中plda基因中导入的突变包括plda基因的缺失，mlta基因中导入的突变包括mlta基因的缺失。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述plda基因编码seq id no:10所示氨基酸序列或包含seq id no:11所示核苷酸序列；所述mlta基因编码seq id no:6所示氨基酸序列或包含seq id no:7所示核苷酸序列。
16.根据权利要求12所述的方法，所述经修饰的百日咳鲍特菌菌株衍生自baa-589株。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述突变通过同源重组或靶向诱变来导入。
18.一种产生百日咳鲍特菌外膜囊泡(omv)的方法，所述方法包括以下步骤：
19.一种组合物，其包含有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株或通过权利要求12-17中任一项的方法产生的经修饰的百日咳鲍特菌菌株。
20.根据权利要求1-11任一项所述的经修饰的百日咳鲍特菌菌株，和/或通过权利要求12-17中任一项的方法产生的百日咳鲍特菌菌株，和/或根据权利要求19所述的组合物在制备用于预防和/或治疗对象中的百日咳鲍特菌感染的药物或疫苗中的用途。
